Белковых и ферментных препаратов

Основы технологии выделения, концентрирования и очистки

Проведение этих стадий процесса обусловлено рядом технических сложно­стей, связанных, в основном, с нестабильностью (лабильностью) ферментов, потерей им активности под влиянием незначительных изменений внешних условий. Поэтому при выборе технологии выделения, концентрирования и очист­ки ферментных препаратов ищут решения, позволяющие проводить эти процессы в непрерывном режиме, с высокой скоростью, в "мягких" усло­­ви­ях и добиваться максимального обезвоживания образующихся осадков. Для умень­шения потерь продуктов приме­няют различные стабилизаторы ферментов, прово­дят процесс при оптимальном значении рН растворов, стараются обеспе­чить максимально возможную механизацию и автоматизацию всех процессов.

Для предварительного концентрирования растворов ферментов перед их осаждением и сушкой используют процесс вакуум-упаривания. Его стараются проводить при нейтральных значениях рН раствора. При значениях рН раствора меньше 4,5 и больше 8,2 активность ферментов начинает падать уже при нагревании раствора выше 35°С. При рН = 6 тот же эффект наблюдается лишь при температуре выше 50°С. Установлено, что чем меньше время выпаривания, тем выше может быть температура греющего агента, а выпаривание наиболее очищенного раствора ферментов сопровож­дается большей потерей активности фермента.

Последнее объясняется тем, что присутствующие в растворе примеси "защищают" выделяемый фер­мент от неблагоприятных температурных воздействий.

Процесс выпаривания чаще всего проводят в пленочных или роторных выпарных аппаратах. Потеря активности фермента в таком процессе может достигать 5-20%. С целью возможного снижения этой величины к выпа­риваемому раствору добавляют белки-стабилизаторы: альбумин, казеин или осуществляют выпаривание вместе с клетками продуцента. В качестве стабилизаторов используют и такие соли, как хлориды кальция, натрия и ацетат кальция. Правильный в качественном и количественном отношении подбор стабилизаторов позволяет при минимально допустимых потерях активности ферментов увеличить скорость процесса выпаривания раствора за счет повышения температуры греющего пара.

Технически более сложно осуществить процесс вакуум-упаривания непо­средственно культуральных жидкостей. По сравнению с водными экстрак­тами содержание сухих веществ в них в 4-5 раз ниже и составляет 2,5-3,5%. В ходе концентрирования раствора в осадок выпадают гидроксиды, сульфаты, карбонаты и фосфаты кальция, магния и других металлов. Это приводит к изменению солевого состава и рН раствора, что способствует инактивации фермента.
Часто полученный в процессе упаривания культуральной жидкости концен­трат ферментов отделяют от осадка и, не подвергая дальнейшей очистке, добавляют к нему раствор хлорида натрия, чтобы довести концентрацию препарата в нем до 50% и предотвратить инфицирование продукта посто­ронней микрофлорой. Полученный таким образом препарат марки Г2х разли­вают по емкостям в 40-50 мл и отправляют потребителю.

Для концентрирования и выделения ферментных препаратов часто приме­няют процесс высаливания. Он основан на уменьшении растворимости большинства белков в солевых растворах. Для этой цели в технологии чаще всего используют сульфат аммония как наиболее дешевый и хорошо растворимый реагент. Однако недостатком использования сульфата аммония является выделение аммиака при повышенных значениях рН раствора, что приводит к коррозии металлических частей оборудования.

Тот же эффект высаливания достигается при использовании сульфата натрия вместо сульфата аммония. Однако из-за меньшей по сравнению с сульфатом аммония растворимостью его можно использовать при темпера­турах раствора не ниже 35-40°С. При охлаждении раствора наблюдается выпадение осадка сульфата натрия, что создает возможность его регенерации и повторного использования. Однако использование сульфата натрия предполагает повышение энергозатрат на нагревание растворов, а пребывание ферментов в условиях повышенных температур способствует их инактивации.

При проведении процесса высаливания большое значение имеет режим осуществления контакта соли с раствором фермента. Для высаливания можно брать соль в виде тонкоизмельченного порошка или в виде насыщенного раствора. В последнем случае процесс можно проводить в периодическом или непрерывном режиме. Установлено, что наибольший эффект - минимально необходимое количество соли на 1 кг осаждаемого белка - достигается при использовании соли в виде тонко измельченного порошка. Наименьший эффект достигается при непрерывном смешении насыщенного раствора соли с раствором фермента. Для достижения того же процента высаливания в последнем случае соли требуется в 1,3-1,5 раза больше.

Время образования осадков белков при высаливании для различных фер­мен­тов колеблется в пределах 0,5-12 часов. Время высаливания и необ­ходимое для проведения процесса количество соли зависят от количества (процентного содержания) растворенных веществ. Чем их больше, тем меньшее количество воды подлежит связыванию. Так, например, для полу­чения 1 кг препарата из культуральной жидкости требуется 45-50 кг соли, а из упаренного до 30%-ной концентрации раствора - только 1,4-1,6 кг.

В получаемых таким образом осадках белка содержится 60-85% балластных веществ, в том числе 30-45% соли. Повторное использование операций растворение - высаждение дает возможность получать высоко­очищенные ферментные препараты для медицинских целей.

Варьируя такие параметры, как температура и рН среды, в ряде случаев, возможно, осуществить фракционное высаждение белков. Для этого в присутствии соли изменяют рН исходного раствора или температуру, добиваясь денатурации балластной фракции белка. Последние необратимо выпадают в осадок, который отделяют от маточного раствора. На последующей стадии уже выделяют целевой ферментный препарат.

Довольно часто вместо соли используют полиэтилен гликоль с молекулярной массой 6000. Он оказывает стабилизирующее воздействие на активные белки, легко отделяется от белка методом ионообменной хрома­тографии или ультрафильтрации.

В технологии выделения ферментов методом осаждения значительное место занимает процесс получения активных белков осаждением их с помощью органического растворителя. Действие органических растворителей осно­ва­но на снижении диэлектрической постоянной среды, которая определяет величину силы электростатического взаимодействия между молекулами растворенного белка и растворителя. Устойчивость белковых растворов обусловлена толщиной гидратного слоя, окружающего молекулу белка. При разрушении этого гидратного слоя молекулы белка начнут образовывать конгломераты и выпадать в осадок. Для осуществления такого процесса необходимо исполь­зо­вать вещества более гидрофильные, чем осаждаемый белок. В качестве растворителей используют, в основном, этанол, метанол, изопропанол и ацетон. Варьируя тип органического растворителя, его количество, величину рН раствора можно проводить избирательное осаждение той или иной фракции белков.

В технологии процесс осаждения органическим растворителем проводят в реакторе непрерывного и периодического действия. Для снижения процента по­терь активности выделяемого фермента при смешении растворителя с водным раствором активных белков обе жидкости первоначально охлаждают до температур соответственно -5 ± -8° С и 5 ± 6° С. Полученную смесь, со­дер­жащую не менее 8-10% белков, тщательно перемешивают, и через 20-30 мин происходит выпадение мелких частиц белка. Процесс осаждения проводят в вертикальном цилиндрическом аппарате с коническим днищем, снабженным мешалкой и рядом штуцеров для удаления жидкой фазы. Потеря активности фермента на этой стадии составляет около 15%, в основном, по причине длительного контакта фермента с органическим растворителем. Организация процесса по способу непрерывного осаждения при времени контакта 10-15 мин позволяет снизить потери активности фермента на 20-25%.

Полученный на этой стадии осадок отделяют на центрифуге, промывают чистым этанолом и вновь сепарируют до остаточной влажности 30-35%.

Для получения высокоочищенных ферментных препаратов, полученные на стадии выделения активные белки подвергают, как правило, сорбционной чистке. Поскольку в молекуле фермента присутствуют функциональные группы, сообщающие ей кислотный или основной характер, то обычно для этой цели используют метод ионного обмена на ионитах, полученных на основе целлюлозы: катионит КМЦ (карбоксиметилцеллюлоза) и анионит ДЭАЭ (диэтиламиноэтилцеллюлоза).

В последние годы число различных ионитов сильно возросло, и для конкретного производства ферментного препарата существует возможность выбрать наилучший. Среди ионитов, получивших достаточно широкое распространение, необходимо отметить такие, как обработанный крахмал, сефадексы на основе декстрана, катиониты на основе полиметакриловой кислоты, аниониты на основе поливинилового спирта и др.

Процесс проводят в насадочных колоннах, через которые пропускается раствор фермента, или в аппаратах с мешалкой. В последнем случае предпо-лагается последующее отделение твердой фазы.

Десорбцию осуществляют элюирующими растворами, специально подобранными для каждого фермента и сорбента.

Потери фермента на стадии сорбционной чистки не превышают 15%. Для получения более высокоочищенных ферментов используют различные препаративные методы. Среди них наибольшее распространение получили такие, как диализ, гельфильтрация, вымораживание, электрофорез, аффинная хроматография и др.

Диализ - процесс диффузии ионов через полимерную мембрану под действием градиента концентраций. При этом за счет диффузии через мембрану удаляются соли и другие низкомолекулярные продукты, а их место в исходном растворе ферментного препарата занимают молекулы раство­рителя, в данном случае воды. И хотя исходный раствор фермента при этом увеличивается в объеме, но активность его возрастает в 3-4 раза.

В последние годы с развитием промышленности по производству синте­тических пленок сильно возрос интерес к использованию процесса диализа в промышленном масштабе и был создан для его осуществления ряд про­мышленных установок.

Разновидностью процесса диализа является электродиализ. Перенос ионов через мембраны осуществляется в этом случае не за счет градиента концентраций, а под действием электрического поля.

Вымораживание - метод основан на частичном замораживании раствора ферментного препарата. Образующиеся при этом кристаллы льда отделяют на центрифуге. Фермент концентрируется в водной фазе. Подбирая условия замораживания исходного раствора можно фракционировать белки по составу и еще более сконцентрировать целевой фермент.

Электрофорез - метод, основанный на различной подвижности ионов в электрическом поле. Процесс достаточно длительный. За счет диффузии может происходить размытие концентрационных зон. Частичная интенси­фи­ка­ция процесса возможна за счет создания температурного градиента. Применяется, в основном, для получения высокоочищенных препаратов в лабораторных условиях.

Аффинная хроматография – метод, основанный на способности ферментов избирательно связывать те или иные лиганды - субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффекторы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной фермент из множества других белков.

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители).

Для глубокой очистки целевых продуктов применяют следующие операции:

Дата добавления: 2014-01-04