Микроскопия в темном поле

В основе метода лежит эффект Тиндаля — рассеивающийся пучок света при наблюдении сбоку имеет вид голубоватого конуса на темном фоне. Другими словами, при освещении объекта косыми лучами света эти лучи, не попадая в объектив, остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит темным. В то же время оптически неоднородные клетки, находящиеся в поле зрения и попадающие в сферу прохождения лучей, отклоняют их в такой степени, что лучи попадают в объектив. Поскольку лучи света идут именно от объектов, наблюдатель видит их в темном поле интенсивносветящимися.

Темное поле зрения можно созватьв светооптическоммикроскопе, заменив обычный конденсор темнопольными применив источник сильного света. Однако эффект темного поля может быть достигнут только в случае, если апертура конденсора превышает на 0,2—0,4 единицы апертуру объектива. Для исследования в темном поле рекомендуют конденсорс апертурой около 1,2 и объективы с апертурой 0,65-0,85. Важно обращать внимание на толщину предметных (0,8 — 1,2 мм) и покровных (0,17 мм) стекол, толщину препарата (в воде) и чистоту используемых стекол. Чем толще препарат и чем больше в нем посторонних частиц, преломляющих световые лучи, тем менее контрастно получаемое изображение, так как каждая частица, отражая лучи, освещает поле зрения.

Метод используется при исследовании живых клетокмикроорганизмов. Он особенно ценен для функционально-морфологического изучения крупных объектов, например дрожжей. Цитоплазма дрожжевых организмов (при условии яркого источника света и хорошего апохроматического иммерсионного объектива) опалесцирует слабо и равномерно. На ее фоне четко различаются черные, оптически пустые вакуоли, капли жира в виде сильно блестящих гранул. Протопласт погибающих клеток опалесцирует молочно-белым цветом.

1.3. Микроскопия с фазово-контрастным устройством

Глаз человека различает световые волны по длине(цвет) иамплитуде (интенсивность, контрастность). Но не различает их по фазе.

Почти вес живые клетки прозрачны, так как световые лучи, проходя через них, не меняют своей амплитуды, хотя и изменяются по фазе. Превратить « фазовый » (неконтрастный) препарат в «амплитудный» (контрастный) можно, либо окрашивая объект (для живых клеток этот прием малопригоден ), либо снижая апертуру конденсора путем прикрываниядиафрагмы (прием также нежелателен, так как снижает разрешающую способность микроскопа).

Метод фазово-контрастной микроскопии разработан для наблюдения за прозрачными объектами. Он основан на преобразовании фазовых изменений, претерпеваемых световой волной при прохождении через объект, в видимые имплитудные с помощью определенного оптического устройства.

Если в объективобычного микроскопа вмонтировать специальный диск - фазовую пластинку с кольцом (получается путем напыления диска солями редких металлов толщиной в несколько десятых микрометра), а в конденсор — кольцевую диафрагму (непроницаемую для лучей света пластинку с прозрачной щелью в виде кольца) так, чтобы через конденсор и объектив проходило лишь кольцо света, которое затем совмещается с кольцом фазовой пластинки объектива, то фазы проходящего светового луча сдвигаются (обычно на '/₄ длины волны), фазовые изменения переходят в амплитудные и препарат становится контрастным.

Для проведения исследований необходимо в дополнение к световому микроскопу иметь фазово-контрастное устройство (наиболее широко распространена модель КФ-4), которое состоит из фазовых объективов (на оправе имеется буква «Ф»), конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа (оптического устройства, помещаемого в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста).

Метод применяю для исследования живых клеток микpoopганизмов, контрастность которых достигается оптическим путем без вмешательства в их физиологические процессы.

Дата добавления: 2014-01-04