Выявление нитрифицирующих бактерий на плотных средах

Нитрификация

Вводные пояснения. Под нитрификацией понимают про­цессы окисления аммиака до нитрита и нитрата. Эти превра­щения идут в две фазы. Вызывают их нитрифицирующие бак­терии главным образом двух родов:

Nitrosomonas: NH⁺₄ + l'/₂O₂ → NO^-₂ + 2H + H₂O

Nitrobacter: NO^-₂ + '/₂О₂ → NO^-₃

Энергию, выделяющуюся при окислении аммиака и ни­трита, нитрификаторы используют для ассимиляции диоксида углерода. Бактерии, осуществляющие данный процесс, отно­сятся к хемолитоавтотрофам и представляют собой облигатных аэробов.

Первая фаза нитрификации. Для выявления бактерий первой фазы нитрификации и определения относительного количества их в почве используют метод Виноградского на гелевых пластинах (см. 7.2.1).

Промытые и прокипяченные пластины кремнекислого ге­ля (в чашках Петри) пропитывают 3—5 мл среды Виноградско­го. Минеральная основа среды имеет следующий состав (г/200 мл дистиллированной воды): (NH₄)₂SO₄ — 2,0; К₂НРО₄ — 1,0; MgSO₄ - 0,5; NaCl - 0,4; FeSO₄ • 7Н₂О - 0,4; MgCO₃ или СаСО₃ — 5,0. Источник азота (NH₄)₂SO₄ — 2 г. Лучшие резуль­таты получают при замене (NH₄)₂SO₄ на фосфорно-аммоний-но-магниевую соль — NH₄MgPO₄ · MgCO₃; кроме того, важно растереть СаСО₃ перед приготовлением среды пестиком в сте­рильной ступке.

Питательную среду в чашках упаривают при 40—50 ºС до образования белой блестящей эмалевой поверхности, возни­кающей за счет равномерного распределения слоя MgCO₃ или СаСО₃. Слой любого из этих веществ служит индикатором процесса нитрификации, так как в тех местах на геле, где раз­виваются нитрифицирующие бактерии, появляются зоны рас­творения карбонатов, в которых эти микроорганизмы и обнаруживаются.

По эмалевой поверхности пластин раскладывают опреде­ленное число комочков свежей почвы, для чего берут два часо­вых стекла и стерилизуют их фламбированием. Затем в одно часовое стекло помешают почву, а в другое наливают дистил­лированную воду. Палочкой с оттянутым концом, предвари­тельно слегка проведя ее над огнем и смочив водой, захватыва­ют комочки почвы (диаметром 1—2 мм) и по трафарету рас­кладывают их по поверхности эмалевых пластин.

Чашки помещают во влажную камеру и ставят в термо­стат при 28—30 ºС. Через некоторое время (спустя 7, 14, 21 сут), в зависимости от активности нитрифицирующих бактерий, вокруг отдельных комочков почвы появляются зоны растворения мела, свидетельствующие об обрастании комочков почвы ни­трифицирующими бактериями.

Чашки вынимают и подвергают анализу: определяют сте­пень обрастания комочков почвы нитрифицирующими бакте­риями (в %), изучают морфологию их представителей и про­дукты жизнедеятельности.

Степень обрастания комочков почвы определяют следую­щим образом. Общее число комочков почвы, разложенных на чашке, принимают за 100%. Затем подсчитывают число комоч­ков почвы, давших зоны растворения мела, и устанавливают, какой процент они составляют от общего числа комочков поч­вы. Полученная величина не дает представления об абсолют­ном количестве нитрифицирующих бактерий в почве. Однако если сопоставить степени обрастания ими комочков разных почв, то этот показатель позволит судить о том, в какой почве содержится больше нитрифицирующих бактерий.

Чтобы определить продукты жизнедеятельности бакте­рий первой фазы нитрификации, чистым ланцетом вырезают по 3 кусочка геля из зон растворения мела и с мест, в кото­рых мел не растворился, помещают их изолированно в лунки белой фарфоровой пластины или в фарфоровые чашки. Сна­чала делают пробы с кусочками геля контрольных участков, где мел не растворился. Пробу на аммиак выполняют с реак­тивом Несслера: гель приобретает желтовато-оранжевую ок­раску, что свидетельствует о присутствии аммиака. Затем проводят пробу на нитрит с реактивом Грисса или цинк-иод-крахмалом, добавляя каплю 10%-ной серной кис­лоты: гель остается без изменений, что указывает на отсут­ствие нитрита.

Аналогичные пробы делают с кусочками геля, взятыми из зон растворения мела (или MgCO₃). В этом случае реакция на аммиак с реактивом Несслера отрицательная, т. е. гель не окрашивается. Реактив Грисса окрашивает гель в красный цвет, а цинк-иод-крахмал в кислой среде — в темно-синий, что свидетельствует о появлении азотистой кислоты.

Для знакомства с возбудителями первой фазы нитрификации из зон рас­творения мела берут иглой немного ма­териала и готовят окрашенный препарат. При его микроскопировании можно об­наружить овальные клетки, похожие на ноль, — Nitrosomonas (рис. 23) и Nitrosospira. Первые встречаются в старопахот­ных почвах, вторые - в целинных. В почвах Европы чаще встречаются Ni trosomonas europea

Вторая фаза нитрификации. Бактерии, вызывающие вто­рую фазу нитрификации, можно наблюдать на чашках с куль­турой первой фазы при более длительном их выдерживании в термостате. После исчезновения аммиака образовавшийся нитрит может окисляться до нитрата. В этом легко убедиться по исчезновению в среде нитрита и появлению нитрата. Для этого вырезают чистым ланцетом два кусочка геля, помещают их в фарфоровые лунки и об исчезновении нитрита судят по отрицательной реакции с реактивом Грисса или цинк-иод-крахмалом в кислой среде. С другим кусочком геля проводят пробу на нитрат с дифениламином в растворе кон­центрированной серной кислоты. В присутствии азотной кис­лоты гель приобретает темно-синий цвет (реакцию на нитрат с дифениламином делают только в отсутствие нитрита).

В препарате, приготовленном из мест растворения мела, взятого с поверхности чашки, в этот период можно обнару­жить возбудителей второй фазы нитрификации — мелкие, слегка искривленные и угловатые клетки Nitrobacter.

В связи с тем, что коэффициент полезного действия хемо­синтеза у нитрифицирующих бактерий очень низкий, рост их клеточной массы незначителен и на препаратах, приготовленных обычным способом, они обнаруживаются не всегда или с трудом.

Выявление бактерий обеих фаз нитрификации по Теппер. Для выявления бактерий обеих фаз нитрификации из культу­ры на гелевых пластинах был разработан специальный прием. В чашку, в которой прошли процессы нитрификации, осто­рожно вливают 6-8 мл водопроводной воды, бактерии при этом поднимаются на ее поверхность. Ели к поверхности воды прикоснуться чистым обезжиренным предметным стеклом, то на нем останутся нитрифицирующие бактерии. После суш­ки и фиксации препарат красят фуксином и рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой.

На препаратах из чашек, в которых прошли первая и вторая фазы нитрификации, можно легко обнаружить предста­вителей обоих родов нитрифицирующих бактерий и их спутни­ков, в частности бактерии рода Bactoderma, всегда сопровождающие вторую фазу нитрификации.

Для специального наблюдения за процессом второй фазы нитрификации опыт также можно ставить на гелевых пласти­нах. Их пропитывают 2—3 мл питательной среды следующего состава (г/200 мл дистиллированной воды): NaNO₂ — 1,0; Na₂CO₃ (безводный) - 1,0; NaCI – 0,5; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄ • 7H₂O - 0,5; FeSQ₄ • 7H₂O - 0,4.

Среду упаривают при 50 ºС до исчезновения свободной воды и по поверхности геля, как и в предыдущем опыте, рас­кладывают комочки почвы. Затем после 20—30 сут инкубации при 28—30 ºС анализируют, как было описано выше.

Дата добавления: 2014-01-04