Ассоциативные бактерии

Материалы и оборудование

Гелевые пластины, пропитанные средой Виноградского для азотобактера (при отсутствии гелевых пластин используют жидкие питатель­ные среды Виноградского или Бейеринка), часовые стекла, почва, па­лочки с оттянутым концом, цилиндры, колбы Эрленмейера на 100 мл. Микроскопы и вес необходимое дли микроскопирования.

Вводные пояснения. К настоящему времени известно бо­лее 200 видов (24 рода) ассоциативных диазотрофов: Azospirillum, Achromobacter, Arthrobacter, Beijerinckia, Enterobacter, Klebsiella, Aquaspirillum, Xanthobacter и др. Для них характерна ко­лонизация корней растений без образования выраженных морфологических структур, но с положительным эффектом на продуктивность растения.

Научным центром по разработке бактериальных препа­ратов на основе ассоциативных бактерий в России является ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петер­бург). Наиболее известны препараты Агрофил, Агрофор, Ризоэнтерин, Биоплант, Барьер. Действующим началом в них являют­ся различные ассоциативные бактерии. Спектр их влияния на растения различен.

Учет общей численности ассоциативных диазотрофов. Обычно для этого используют глюкозоавтолизатную среду, минеральной основой которой служит среда Федорова — Кали­нинской (г/л дистиллированной воды): К₂НРО₄ — 1,74; КН₂РО₄ - 0,91; MgSO₄•7H₂O - 0,3; NaCl – 0,5; CaCl•6H₂О — 0,1; FeCl•6H₂O — 0,01. К ней добавляют (г): глю­козу — 10, дрожжевой автолизат — 0,1, бромтимолблау — 0,2, а также смесь витаминов (мкг): биотин — 10, рибофлавин — 200, витамин В₁₂ — 2; тиамин, пиридоксин, пантотенат кальция, никотиновая и парааминобензойная кислоты — по 100.

Среду разливают по 30 мл в конические колбы на 100— 150 мл, стерилизуют в течение 20 мин при давлении 0,5 атм. и инокулируют в трехкратной повторности разведениями поч­венной суспензии от 1: 100 до 1:10 000 000. Культивируют при 25—28 °С 3—4 недели. При подкислении среды до рН 6,0 (желтое окрашивание) добавляют для нейтрализации стериль­ный раствор NaOH (0,1—0,2 н.). По окончании опыта в вариантах, где отмечен рост бактерий, определяют азот мето­дом Кьельдаля (см. 12.5.2). Увеличение исходного содержания азота (0,5—0,7 мг на колбу) на 0,3 мг и более служит показате­лем азотфиксации. Подсчет наиболее вероятного количества азотфиксирующих ассоциаций в образце проводят по таблице Мак-Креди (см. табл. 2).

Для определения азотфиксирующей активности ацетиле­новым методом (см. 12.4.1) через 5—7 сут от начала опыта 3 мл культуральной среды переносят в стерильные пенициллиновые флаконы, закрывают их резиновыми пробками с зажимами и инкубируют в атмосфере с ацетиленом (10%) в течение суток. Наличие азотфиксации определяют по восстановлению ацети­лена до этилена.

Количественный учет азотфиксирующих ассоциаций мо­жет быть проведен непосредственно при посеве почвенных разведений в пенициллиновые флаконы. В каждый флакон вносят 3—3,5 мл среды (дрожжевого автолизата в среду в этом случае добавляют 0,06 г на 1 л). Через 3—4 сут среду нейтрали­зуют стерильным раствором 0,05—1 н. NaOH (если есть подкисление), ватные пробки заменяют резиновыми и в каждый флакон вводят 1 мл ацетилена. Количество образовавшегося этилена определяют на 1-е, 3-и и 7-е сут инкубации. Достовер­ными считают варианты, где количество этилена выше 5— 6 нмоль (наномолей) на флакон. Расчет численности проводят по табл. 2.

На описанной выше среде растут бактерии рода Xanthobacter, которые в чистой культуре не используют углеводы. Развиваются также факультативные анаэробы — энтеробактерии. Клостридии и азотобактер на данной среде не растут.

Количественный учет ксантобактера осуществляют в пенициллиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками, в атмосфере Аr (аргона), Н₂, СО₃ и О₂ по Калининской—Редькиной. Можно определять численность методом предельных разведений на жидкой среде с метанолом. Состав среды (на л дис­тиллированной воды): минеральная основа по Федорову—Ка­лининской (см. выше), витамины (можно использовать только биотин) — 10 мкг/л, метанол — 2,0 г и дрожжевой автолизат — 0,06 г. Ацетилен вводят во флаконы на 2—3-й день после посева. Количество образующегося этилена определяют на 7-е сут инкубации. Численность рассчитывают по таблице Мак-Креди (см. табл. 2). Микроскопируют после высева на мине­ральные агаризованные среды с метанолом или на картофель­ный агар.

Азотфиксирующие бактерии рода Aquaspirillum — аэроб­ные, грамотрицательные, подвижные бактерии размером 0,7 х 1,4мкм. На обычных питательных средах (МПА) колонии мелкие, бесцветные, круглые, клетки слабоизогнутой бобовид­ной формы. На жидких пептонных средах с янтарной кислотой и минеральными солями в среде появляются типичные спира­левидные, но более крупные (6—10 мкм) клетки.

Наибольший интерес среди ассоциативных азотфиксирующих бактерий представляют выявляемые в больших коли­чествах на корнях трав, особенно злаков, спириллы с высокой азотфиксирующей активностью, получившие родовое название Azospirillum. Они живут в ассоциациях с растениями, распрост­ранены и в почве, но преобладают в зоне корня, на корнях и даже в корнях таких растений, как пшеница, рис, тропиче­ские травы. Для проявления их азотфиксирующих способнос­тей необходимо пониженное содержание кислорода в среде.

Азоспириллы — утолщенные вибрионы или палочки с заостренными концами, шириной около 1 мкм, подвижные за счет одного или пучка жгутиков в молодом возрасте и те­ряющие подвижность при переходе в состояние цист в старых культурах. В клетках много гранул поли-β-оксимасляной кис­лоты.

Для получения культуры азоспирилл отмытые кусочки корней длиной 5—8 мм размягчают при помощи профламбированного пинцета и помещают в элективную полужидкую среду без азота следующего состава (г/л дистиллированной воды): L-яблочная кислота — 5; К₂НРО₄ — 0,5; MgSO₄•7H₂O — 0,2; NaCl — 0,1; CaCl₂ - 0,02; КОН - 4; агар - 7,75. Сюда же до­бавляют (мл): раствор микроэлементов — 2; бромтимоловый синий (5%-ный спиртовой раствор); Fe-ЭДТА (1,64%-ный рас­твор) — 4, раствор витаминов — 1. Раствор микроэлементов включает (г/200 мл дистиллированной воды): Na₂MoO₄•2Н₂О - 0,2; MnSO₄•H₂O - 0,235; Н₃ВО₃ - 0,28; CuSO₄•5H₂O — 0,008; ZnSO₄•7H₂O - 0,024. Раствор витами­нов (г/10 мл дистиллированной воды): биотин — 10, пиридоксин — 20.

Доводят рН среды до 6,8, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °С. Не перемешивая среду после инокуляции корнями или почвой, инкубируют флаконы 40 ч при 32 °С. Затем проверяют нитрогеназную активность. Если развившиеся на поверхности среды плотные пленки культуры восстанавливают ацетилен, делают рассев на чашки с этой же средой с 1,5% агара и 20 мг дрожжевого экстракта на 1 л сре­ды. Через неделю мелкие белые плотные колонии пересевают на полужидкую среду BMS, где A. lipoferum развиваются в виде типичных розовых, реже красных и желтых, часто складчатых колоний.

Среду BMS готовят следующим образом. 200 г отмытого очищенного картофеля, нарезанного ломтиками, помешают в марлевый мешок, кипятят 30 мин в 1 л воды, фильтруют че­рез вату. Фильтрат сохраняют. Затем 2,5 г L-яблочной кислоты растворяют в 50 мл воды и добавляют 2 капли бромтимолового синего и КОН (около 2 г), пока раствор яблочной кислоты не станет зеленым (рН 7,0).

Готовые растворы яблочной кислоты, витаминов (1 мл) и агар (15 г) добавляют к фильтрату, доводят объем дистилли­рованной водой до 1 л, кипятят до растворения агара и стери­лизуют 15 мин при 121 °С.

Хорошие результаты дает использование картофельного агара без яблочной кислоты и витаминов.

При изучении кислых лесных почв, не содержащих ни азоспирилл, ни азотобактера, яблочная среда может приме­няться для выделения и учета энтеробактерий (инкубация при комнатной температуре).

Дата добавления: 2014-01-04