КАТЕГОРИИ: Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748) |
Определение общей численности микроорганизмов в почве методом прямого счета под микроскопом
Материалы и оборудование (к 10 2 10.3.Л) Питательные среды (МИА и КАА), жидкие среды в пробирках; среда для аэробных целлюлозоразрушающих бактерий; среда для анаэробных азотфиксаторов; гелевые пластины, пропитанные питательной средой для азотобактера и аэробных целлюлозоразрушающих бактерий; стерильные чашки Петри, колбы со стерильной водопроводной водой по 90 мл, стерильные пипетки Мора на 10 мл, стерильные градуированные пипетки на 1 мл, стерильные шпатели Дригальского, часовые стёкла, стеклянные палочки с оттянутыми концами; свежие пробы почв разных типов; чайные ложки, пинцеты, трафареты, лупы, микроскопы, предметные стекла и все необходимое для приготовления окрашенных препаратов в раздавленной капле и микроскопирования. Метод прямого счета стали применять после того, как обнаружили, что кислые красители хорошо прокрашивают на препарате вегетативные клетки микроорганизмов и слабо - почвенные частицы. Наиболее точно численность микроорганизмов в почве определяют методом Виноградского. Исследования, проведенные этим методом, показали, что разные почвенные фракции содержат неодинаковое чисто микроорганизмов. Меньше всего их во фракции крупных частиц почвы, больше всего — в дисперсной фракции, содержащей максимум органического вещества. Метод имеет ряд достоинств, но достаточно труден и поэтому широко не используется. Метод Виноградского в модификации Шульгиной чаще применяют и лабораторной практике. Сущность его в следующем. Из средней почвенной пробы (см. 10. 1.1) берут 5 г и вносят в колбу Эрленмейера на 250 мл, содержащую 50 мл стерильной водопроводной воды. Навеску почвы предварительно растирают в стерильной агатовой или фарфоровой ступке с небольшим количеством стерильной воды. Дли черноземных и темно-каштановых почв навеску растирают с 0,1%-ным раствором пирофосфата натрия. Затем 5 мин встряхивают и в течение 2—5 с дают осесть грубым частицам.
Из полученной взвеси стерильной градуированной пипеткой берут 0,01 мл и переносят на хорошо обезжиренное стекло. Одновременно с суспензией на стекло помещают каплю 0,1%-ного раствора агара (хорошо отмытый агар готовят на дистиллированной воде). Агар и суспензию на стекле перемешивают и стерильным покровным стеклом распределяют по трафарету на 4 см2. Трафарет — заштрихованный тушью на миллиметровой бумаге квадрат площадью 4 см2, приклеенный к предметному стеклу с нижней стороны. Препарат сушат, фиксируют 96%-ным спиртом и красят карболовым эритрозином (от 30 мин до одних суток). При окрашивании стекла погружают в раствор эритрозина. Остаток красителя смывают, опуская стекла в воду тыльной стороной. Затем препарат снова сушат и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Для получения более точных результатов подсчитывают 10 полей зрения и определяют среднее число клеток в одном поле зрения. Одновременно устанавливают площадь поля зрения: р =πr 2 (см. 5.1.3). Диаметр поля зрения измеряют при помощи объектного микрометра. Затем находят, сколько полей зрения (К) размещается на площади мазка (Р), равной 400 мм2 по формуле:
Пример расчета. Если диаметр поля зрения равен 0,16 мм, а площадь поля зрения соответствует 0,02 мм2, то К = 400: 0,02 = 20 000 (полей зрения). Среднее число клеток в поле зрения умножают на К и устанавливают число клеток в 0,01 мл суспензии. Для определения количества клеток в 1 мл суспензии полученное число умножают на 100, для подсчета в 1 г абсолютно сухой почвы — на степень разведения и делят на навеску абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.
Использование метода прямого учета почвенных микроорганизмов по Виноградскому в модификации Шульгиной показало, что в почве содержится в сотни и тысячи раз больше клеток микроорганизмов, чем удается учесть методом питательных пластин.
Метод учета численности бактерий в почве при помощи люминесцентной микроскопии по Звягинцеву и Кожевину дает еще более достоверный результат по сравнению с методом Виноградского. Суть его в том, что приготовленные из почвенной суспензии препараты окрашивают специальным красителем — акридином оранжевым (флуорохромом). Окрасившиеся в ярко-зеленый цвет клетки хорошо заметны на темном или красном фоне почвенных частиц и препарата, причем микроскопия в отраженном свете позволяет учитывать и адсорбированные почвенными частицами клетки, которые, как правило, не видны в проходящем свете. Порядок подготовки препарата: 1) почвенную суспензию с соотношением почвы и воды 1: 10 (10 г почвы на 90 мл воды) обрабатывают на ультразвуковой установке УЗДН-1 с диспергирующей насадкой в течение 3 мин при силе тока 0,40 А и частоте 15 кГц. Обработка почвы ультразвуком способствует не только разрушению почвенных агрегатов и десорбции микроорганизмов, но и дезагрегации микроколоний в почве. Затем почвенную суспензию переносят в мерный цилиндр на 100 мл. После отстаивания (2 мин) пипеткой отбирают 2 мл суспензии из средней фракции, т. е. возле отметки на цилиндре «50 мл», и переносят в колбу с 18 мл воды; 2)колбу энергично встряхивают, суспензию из неё наносят микропипеткой на тщательно обезжиренное предметное стекло (0,01 мл на препарат) и равномерно распределяют петлей по площади 4 см2 (квадрат 2x2). На каждом стекле можно приготовить 3 препарата. Удобнее предварительно начертить расположение квадратов в натуральную величину на бумаге и класть на нее предметные стекла для приготовления препаратов; 3)препараты высушивают на воздухе при комнатной температуре. Затем после фиксации легким нагреванием на пламени газовой горелки препараты окрашивают водным раствором акридина оранжевого (разведение 1: 10 000) 2—4 мин; 4)избыток красителя удаляют в процессе промывки, для чего стекла погружают на 10 мин в стакан или кювету с водопроводной водой. Окрашенные препараты высушивают при комнатной температуре;
5)для микроскопии на препарат наносят каплю воды и покрывают покровным стеклом. Приготовленный препарат не должен содержать пузырьков воздуха, лишнюю воду снимают фильтровальной бумагой. Препарат просматривают на люминесцентном микроскопе МЛ-2 или МЛ-4 (фильтры ФС-1-2, ЖЗС-19, ЖС-18, объектив 90хЛ, окуляры 4х или 5х). Число клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы (М), определяют по формуле где 4 — площадь квадрата, см2; а — среднее число клеток в поле зрения; р — площадь поля зрения (мкм2); Н — показатель разведения (в данном случае Н = 100, что приемлемо для поверхностных горизонтов почв основных типов, однако степень разведения может быть изменена в зависимости от численности микроорганизмов в конкретном образце; желательно подобрать разведение таким образом, чтобы среднее число клеток в поле зрения составляло 5—10); 1010 — коэффициент, который получается при измерении площади мазка в мкм и расчете Н в мл. Из каждого почвенного образца готовят два препарата и на обоих препаратах подсчитывают клетки в 5 полях зрения. Поля зрения выбирают не произвольно, а переходят к новому полю зрения, поворачивая микровинт столика на определенную величину. Учет при помощи люминесцентной микроскопии требует соответствующего оборудования. При его отсутствии следует применять метол Виноградского в модификации Шульгиной.
Дата добавления: 2014-01-04; Просмотров: 1630; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы! Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет |