Ембріонального розвитку

Основні рушійні механізми

Питання:

1. Клітинна детермінація і диференціація.

2. Індукційна система. Природа індукуючих речовин.

3. Генетичні основи клітинної диференціації.

4. Особливості стадій зародка і плода.

Клітинна детермінація і диференціація. В умовах нормального розвитку перетворення окремі частини організму в цілому строго погоджені по строках, місцю й обсязі змін. Процес, у результаті якого відносно однорідний матеріал зародка в ході ембріогенезу перетвориться в стійкі елементи, різнорідні за морфологією, біохімічними показниками, функціями тощо, називають диференціацією.

Цей процес поширюється на всі головні структурні рівні організму. Так, виникнення розмаїтості типів клітин відповідає явищу цитологічної (клітинної) диференціації, а утворення різних тканин – гістологічної.

У процесі диференціації клітинний матеріал ембріональних закладок перетвориться в певний елемент дорослого організму. Мезодермальні соміти підрозділяються на дерматом, склеротом і міотом. Перший з названих зачатків дає сполучнотканинні клітини (фібробласти) дерми шкіри, другий – клітини хряща (хондроцити), третій – попереково-смугасті м'язові волокна. Отже, кінцевий результат розвитку окремих ембріональних закладок визначений наперед, або детермінований.

Для позначення зумовленості, необоротності диференціювання в ембріогенезі використають термін «детермінація». Деякі ембріологи ототожнюють із поняттям детермінації сукупність факторів, що обумовлюють закономірний характер формотворчих процесів, або ж вплив однієї частини зародка на інші його частини змушують ці останні до проходження в підходящих умовах фрагмента шляхи свого нормального розвитку.

Ступінь зумовленості шляхів подальшого розвитку конкретної частини зародка в ході ембріогенезу міняється. Так, досвіди з поділу, зрощуванню або перемішуванню бластомерів на стадії дроблення показали, що у видів з радіальним (регуляційним) типом дроблення бластомери декількох поколінь, якщо їх ізолювати й помістити в підходящі умови, проявляють тотипотентність (рівноспадковість), тобто розвиваються в повноцінний організм. У багатьох гідромедуз, наприклад, клітини тотипотентні до стадії 32 бластомерів. Рівноспадковість клітин виявлена в кроликів на стадіях 2 і 4 бластомерів. У мишей нормальний хід розвитку відтворюється як з окремих бластомерів, так і з декількох об'єднаних зародків. У підемо випадку кратного збільшення структур і частин не спостерігалося. За рівноспадковість і тотипотентність клітин зародків людини до стадії 2-4 бластомерів говорять випадки народження двох, трьох, чотирьох, п’яти, шести й навіть семи однояйцевих близнюків. Одна двійня доводиться приблизно на 80, трійня на 6400 і четверня на 512 000 пологів.

На стадії бластули клітини вже не проявляють властивості тотипотентності, однак здатні до перевизначення (трансдетермінації) шляху подальшого розвитку. Досвіди, виконані на зародках амфібій, показали, що перехресні пересадження ділянок екто- або мезодерми приводять до зміни напрямку подальшого розвитку відповідно до нового положення.

Результати аналогічних пересаджень на стадії гаструли свідчать про втрату здатності клітинного матеріалу до трансдетермінації. Таким чином, лабільна детермінація шляхів розвитку, спостережувана на ранніх стадіях, заміняється стабільною детермінацією.

У міру проходження зародком послідовних стадій ембріогенезу відбувається обмеження або навіть втрата окремими зачатками потенції до змін у декількох напрямках, тобто має місце інтеграція розвитку.

На кожній зі стадій ембріогенезу зародок являє собою цілісність, що обумовлює взаємозв'язок і взаємоузгодження розвитку окремих його частин. Диференціація я детермінація здійснюються на тлі інтеграції всіх проявів розвитку в єдиний збалансований процес. Зміна потенцій окремих частин до розвитку відбувається не випадково, а залежно від положення цих частин у зародку, що перетвориться, у ході ембріогенезу в цілому. Така інтеграція робить результати розвитку певними не тільки в деталях, але й у цілому.

Індукційна система. Природа індукуючих речовин. Велике значення в упорядкуванні ході ембріогенезу належить ембріональній індукції. Початок принциповому вивченню цього явища поклав досвіди Т. Шпемана й Г. Мангольда, результати якого були опубліковані в 1924 р. У ньому дорсальна губа бластопора, що підлягає в нормальних умовах ектодермі, що розвивається в структури нервової системи, із зародка гребінчастого (непігментованого) тритона на стадії ранньої гаструли вирізалася й пересаджувалася під ектодерму черевної сторони, що дає надалі епідерміс шкіри зародка приблизно тієї ж стадії розвитку звичайного (пігментованого) тритона. У підсумку на черевній стороні зародок-реципієнта виникали спочатку нервова трубка та інші компоненти комплексу осьових органів – хорда, соміти, а потім формувався додатковий зародок. Спостереження за розподілом пігментованих і непігментованих клітин показали, що тканини додаткового зародка формуються майже винятково із клітинного матеріалу реципієнта. наведені дані переконливо доводять, що в ембріогенезі деякі частини зародка виконують роль індукторів або організаторів (по термінології Г. Шпемана), що намічає шляхи розвитку інших частин. Явище ембріональної індукції складається в спонуканні до розвитку в певному напрямків одних структур зародка в результаті впливу на них інших структур, що виникають на більш ранніх стадіях.

Окремі приклади індукційних впливів обмеженого характеру, наприклад, утворення кришталика з ектодерми під дією зачатка ока, були відомі й раніше. Значення результатів досвіду Г. Шпемана й Г. Мангольд складається у встановленні факту первинної ембріональної індукції, тобто першого кроку в ланцюзі послідовних (вторинних, третинних) індукційних процесів подальшого розвитку.

Дорсальна губа бластопору, що представляє по своїх потенціях хордо-мезодермальний зачаток, є первинним індуктором і організатором в амфібій. У риб йому відповідає дорсальний край бластодиску, у птахів - первинний вузлик.

Зачаток бластопору в амфібій виникає в області сірого серпа. Якщо невелика ділянка кортикального шару цитоплазми яйцеклітини жаби з області названої структури пересадити на черевну сторону іншого зародка, то в останнього індукується додаткова нервова система. Можна припустити, що клітинний матеріал дорсальної губи бластопору успадковує властивості первинного організатора, які були запрограмовані не на рівні яйця.

Численними дослідженнями, виконаними в 20-30-х роках минулого сторіччя, доведено, що в умовах експерименту індукцію розвитку ектодерми в напрямку нервової системи викликають багато факторів – речовин з різних органів безхребетних і хребетних тварин, тканин рослин, неорганічних речовин.

Поряд із цим було встановлено, що існують «специфічні індуктори», тобто речовини, що справляють індукуючу дію в незначних концентраціях, і такі, що розрізняються у кінцевому результаті своєї дії. Так, екстракт із печінки ссавців індукує головним чином мозкові структури, а з кісткового мозку – мезодермальні. При спільному впливі обох індукторів формувався зародок майже нормального виду. У тканинах курячих зародків високоактивні індуктори ставляться до класу білків або нуклеопротеїдів.

У розвитку багатьох зачатків виявляються ланцюги послідовних індукцій. Так, описана індукція очним келихом кришталика, кришталиком і навіть дорослим оком роговиці. Довгастий мозок індукує розвиток слухового пухирця, а останній — хрящову капсулу. На відміну від первинної ембріональної індукції, результатом якої служить утворення
додаткового зародка, приклади, описані вище, ставиться до тихорєцького й органного рівня структурної організації. В основі таких міжорганих і міжтканинних індукцій лежать, очевидно, не хімічні, а контактні впливи одних клітин на інші.

Важливою обставиною служить те, що в нормальному розвитку індуктор робить відповідну дію лише відносно зачатків, які характеризуються сприйнятливістю. Здатність ембріонального зачатка до сприйняття індукційного стимулу називається компетенцією. Таким чином, індукційні процеси в ембріогенезі відбуваються завдяки надбанню одними частинами властивостей індукторів, а іншими - властивості компетентності.

У парах елементів «індуктор - компетентний зачаток» зміст змін, провокованих індуктором, залежить від внутрішніх потенцій зачатка. Так, зачаток стегна задньої кінцівки курчати пересаджували під епітелій зачатка кінцевого (дистального) відділу. Із трансплантата під впливом епітелію, у нормі індукуючого кінцевий відділ крила, із презуптивного матеріалу ноги сформувалась стопа, фаланги пальців. Сучасні дослідження показали, що дія індуктора не сприймається одиночними клітинами, причому клітини в тривимірному скупченні змінюються швидше, ніж будучи розпластані тонким шаром. Чим більше маса індукованого зачатка, тим активніше в ньому відбувається диференціювання частин.

Такі характеристики ембріогенезу, як тотипотентність частин зародка на досить ранніх стадіях, прогресивне обмеження шляхів розвитку зачатків, явище наростаючої диференціації, про які йшла мова вище, добре погодяться з наявністю ланцюгів індукційних процесів. При цьому закономірна зміна індукторів і станів компетентності можуть служити інструментом детермінації послідовних етапів розвитку: від значних (наприклад, формування комплексу осьових органів) до обмежених обсягом органа або клітинної групи.

Спостереження показують, що зачаток майже будь-якого органа проходить у своєму розвитку дві фази. У фазі залежної диференціації його доля багато в чому залежить від дії індукторів і зовнішнього оточення. З певного моменту зачаток вступає у фазу незалежної диференціації здійснює закономірний цикл перетворень навіть при зміні зовнішніх умов. Трансплантація зачатка в нетипове оточення в 1-й фазі приведе до трансдиференціації, в 2-й – не викличе зміни шляху розвитку.

Подання про зміну організаторів і стану компетенції зачатків як факторах детермінації послідовних етапів розвитку структур не суперечить положенню про том. що. на будь-якій стадії організм є цілісністю, а не мозаїкою органів і частин. Цілісність обумовлюється системою зв'язний між окремими елементами зародка, характеристики якої закономірно змінюються. Лише умовно можна говорити про одних частини зародка як про індуктори, а про інші – як про реагуючі елементи. У процесі розвитку, включаючись у різні системи зв'язків, «індуктори й реактори» (по термінології І.І.Шмальгаузена) постійно міняються ролями. Фактори, що обумовлюють закономірний характер підсумку розвитку в цілому й на окремих етапах, виникають у міру диференціації зародка завдяки взаємодії результатів цієї диференціації.

У ході ембріонального розвитку зміни спостерігаються на всіх рівнях структурної організації зародка. До типових перетворень клітинних комплексів ставляться місцеві стовщення або відокремлення шарів, утворення складок, об'єднання або розпад клітинних мас, згущення клітин або їхня концентрація навколо певних структур.

На користь участі зазначених перетворень у формотворчих процесах говорять багато фактів. Так, скупчення мезенхімних клітин передує утворенню зародкових кровоносних судин, хряща, кістці або м'язовій тканині. Клітини із зачатка ока розвиваються в сітківку, перебуваючи в тривимірному скупченні, і в пігментний епітелій, будучи розпластаними. Властиво, це й відбувається в результаті перетворення очного міхура в очний келих при нормальному розвитку.

Механізми, що обумовлюють залежність формотворчих процесів від перетворень клітинних комплексів, поки не з'ясовані. Вони можуть сприяти або утрудняти дифузію речовин, змінювати характер контактних взаємодій.

Важлива роль в ембріогенезі належить проліферації, переміщенням, виборчому сортуванню, диференціації, загибелі клітин зародка.

Клітинне розмноження (проліферація) лежить в основі розвитку всіх органів. Завдяки йому досягається певна маса тканин. В окремих зачатках клітини, що діляться, можуть розташовуватися без видимого порядку або концентруватися в особливих матричних зонах. Останнє спостерігається, наприклад, у зачатку центральної нервової системи, де мітози відбуваються тільки в клітинному шарі, що прилягає до нейроцілю. В окремих випадках від матричної зони залежить подальша доля клітини. Так, у головному мозку, що розвивається, ссавців до кінця ембріонального періоду утворяться на додаток до первинної матричної зони, згаданої вище, вторинні матричні зони, зокрема в мозочку. У таких зонах утворяться тільки дрібні коротковідростчаті нервові клітини, що забезпечують міжнейроновий зв'язок всередині окремих нервових центрів.

Активні клітинні переміщення в ембріогенезі забезпечуються, головним чином, завдяки механізму амебоподібного руху. Траєкторія задається, очевидно, особливостями рельєфу поверхні, по якій клітина рухається, шляхом так званого контактного орієнтування. Деякі типи клітин переміщаються по градієнту концентрації хімічних речовин (хемотаксис), однак цей механізм орієнтації зустрічається рідко.

Рухова активність служить цілям доставки клітинного матеріалу в потрібну область зародка. Так, клітини, що виселяються з гангліозної пластинки, мігрують у зони розвитку чутливих і вегетативних нервових вузлів, наднирників, хрящів зябрових дуг і їхніх похідних. В окремих випадках контакти по ходу руху визначають кінцеву долю клітин. Наприклад, для розвитку симпатичних нервових клітин необхідний контакт із певною ділянкою мезодерми під час руху клітинок-попередниць із гангліозної пластинки в область локалізації симпатичних вузлів.

Явище виборчого сортування складається у виділенні й об'єднанні клітин одного зачатка із суміші, що містить клітини різних зачатків. Воно поширюється на клітинний матеріал як зародкових листків, так і окремих органів. Процес об'єднання подібних клітин носить, очевидно, імовірносний характер. Міжклітинні контакти утворяться випадково, однак зв'язок однотипних клітин відрізняється більшою стійкістю. Значення виборчого сортування в розвитку полягає в остаточному впорядкуванні положення клітин у клітинних комплексах. Злоякісні перероджені клітини не відділяються із суміші з нормальними клітинами, що може лежати в основі їхнього проростання в різні тканини й органи.

Диференціації клітин належить у процесі розвитку особлива роль. Завдяки їй виникають стійкі типи клітин, спеціалізовані до виконання різних функцій. Диференційовані клітини нерідко характеризуються складною морфологією (нервові клітини, палички й колбочки сітківки). Фундаментальною рисою, однак, по якій клітинні типи відрізняються друг від друга служить утворення ними типоспецифічних білків, також речовин іншої хімічної природи, наприклад вуглеводної. Так м'язах синтезується скорочувальний білок міозин, у фоторецепторах – зоровий білок опсин, в еритроцитах – гемоглобін. Наявності цих білків залежить функціональна спеціалізація клітин багатоклітинного організму.

Поряд з типоспецифічними білками клітини, що належать однієї тканини, синтезують деяке число загальних для них тканинноспецифічних білків. Всі клітини, незалежно від клітинної й органної приналежності, утворять клітинні білки, що забезпечують прояви життєдіяльності, загальні для всіх клітин.

У цей час не викликає сумніву, що синтез окремих білків контролюється певними генами, а повний набір генів, за рідкісним винятком (наприклад, без'ядерні еритроцити ссавців), ідентичний у клітинах різних типів.

Генетичні основи клітинної диференціації пояснює гіпотеза диференціальної активності генів. Відповідно до неї розходження в спектрі білків, утворених диференційованими клітинами, відображають розходження в наборі активних генів. У клітинах будь-якого напрямку спеціалізації виділяються ніби три групи активних генів: I) гени, що контролюють фундаментальні процеси життєдіяльності клітин (наприклад, енергетичні) і активні у всіх живих клітинах; 2) гени, що зумовлюють подібні риси клітин однієї тканини (наприклад, збудливість мембрани нервових клітин, наявність у них стійких відростків); 3) гени, що контролюють риси, специфічні для клітин конкретного типу, активність яких лежить в основі, наприклад, морфологічних і цитофізіологічних розходжень грушоподібних нейронів мозочка, нейронів кори великого мозку.

Головний механізм клітинної диференціації, відповідно до сучасних подань, зводиться до виборчого блокування-деблокування або інактивації-активації окремих генів або їх груп. Способи досягнення перерахованих станів генів інтенсивно вивчаються, однак усе ще далекі від розуміння. Більша роль належить, очевидно, зміні фізико-хімічних властивостей хроматину, що багато в чому залежить від характеру взаємодії ДНК, гістонових і негістонових білків.

У ході диференціювання клітин зачатка зародка спостерігається послідовна зміна активних генів. Зручним об'єктом для дослідження цього явища служать гігантські политенні хромосоми клітин деяких органів комах, наприклад дрозофіли. Зони таких хромосом, що містять активні гени, на яких інтенсивно синтезується РНК, виглядають як здуття. Залежно від стадії розвитку й тканинної належності клітини розподіл пуфів варіює.

У міру диференціації число активних генів у клітині, очевидно, прогресивно знижується. Так, з 40 тис. генів геному морського їжака на стадії бластули активно приблизно 30 тис., гаструли й личинки – 12-15, у дорослих тварин – 3-5 тис. генів.

Регуляція генної активності клітин зародка в процесі розвитку Досить складна й багато в чому неясна. Регуляторні впливи роблять речовини цитоплазми яйцеклітини, характер міжклітинних хімічних і контактних взаємодій, гормони.

В ембріональному розвитку багатьох органів і частин організму спостерігається закономірна (запрограмована) загибель клітин вихідного зачатка. Деякі вчені вказують, що вона є інструментом додання зачатку остаточної форми. Так, загибель клітин служить роз'єднанню закладок фаланг пальців у птахів і ссавців. У зачатках, що розвиваються, плеча й передпліччя курки, зони закономірно гинучих клітин розміщені в певних ділянках.

В інших випадках роль клітинної загибелі менш зрозуміла. Наприклад, на певній стадії розвитку багатьох центрів головного мозку ссавців закономірно гине більше половини клітин. При цьому серед клітин, що гинуть, є й такі, відростки яких уже встановили контакт із органом-мішенню.

В ембріогенезі здійснюються інтенсивні формотворчі (морфогенетичні) процеси. Завдяки їм організм у цілому та його окремі частини, з одного боку, здобувають форму, типову для дорослого стану, а з іншого боку – форма конкретних зачатків закономірно змінюється в ході розвитку щодо головних осей тіла зародка. В амфібії, наприклад, бруньки передніх кінцівок спрямовані вершинами вниз і назад. Морфогенетичні перетворення зачатка полягають спочатку в його сплощенні у вигляді «лопатки» або «пластинки», нерівності країв якої відповідають майбутнім пальцям. Усередині зачатка утворяться ущільнення мезенхімних клітин, які, диференціюючись, набувають здатності до синтезу речовини хряща. Хрящові закладки надалі перетворяться в кістякові елементи. На цьому етапі формуються основні відділи кінцівок – плечовий і тазовий пояси, плече або стегно, елементи передпліччя, гомілки, кисті, стопи. Як ми вже відзначали, у перетвореннях хрящових закладок кінцівок відому роль грає закономірна загибель частини клітин. Існує певна тимчасова послідовність утворення закладок різних відділів кінцівки. У цілому проксимальні частини кістяка виникають раніше дистальних. У процесі формування закладок основних відділів спостерігаються закономірні переміщення клітинних комплексів у вигляді згинання, обертання. М'язи утворяться з матеріалу нижніх країв міотомів, що вростає (амфібії) або мігрує (вищі хребетні) у зачаток кінцівки.

У розвитку кінцівки важливе місце належить міжтканинним індукційним взаємодіям. З одного боку, мезенхімні клітини, впливаючи на епідерміс, спонукують його до стовщення, з іншого боку – саме епідерміс обумовлює перетворення форми зачатка – у випадку видалення його може придушуватися розчленовування мезенхіми на хрящі. Так, при пересадженні епітеліального покриву зачатка крила на зачаток ноги курки замість ноги виникає крилоподібна структура. Для з'ясування загальних закономірностей морфогенезу цікаві результати досвідів по розвитку додаткових кінцівок у хвостатих амфібій при підсадженні їм під шкіру між зачатками передньої й задньої кінцівки сторонніх тканин, наприклад слухового пухирця. Розвиток передньої або задньої додаткової кінцівки залежить від того, чи підсаджується тканина-стимулятор ближче до передньої або задньої власної кінцівки. Наведені результати дозволяють припустити наявність розрізняються по морфологічних потенціях «територій передньої й задньої кінцівок» локалізація яких в організмі, що розвивається, точно визначена.

Складний характер перетворень супроводжує і розвиток ротової порожнини й обличчя людини. Процес починається утворенням у місці контакту передньої кишки й ентодерми ротової ямки. Частина дорсальної стінки ротової ямки розвивається в зачаток передньої частки гіпофіза, що з'єднується із зачатком задньої частки гіпофіза. Остання є похідним проміжного мозку. Вхід у ротову яму в зародків ссавців спочатку представляє отвір, обмежений п'ятьма виступам верхнім непарним (лобовий), двома парними верхніми (верхньощелепні відростки) і двома парними нижніми (нижньощелепні відростки). Останні, зростаючись, утворять нижній край ротового отвору. У формуванні верхнього краю ротового отвору беруть участь верхньощелепні відростки, які зростаються з бічним носовими й із середнім лобовим відростками, що виникають у результаті перетворення лобового виступу. На середньому лобовому відростку утвориться поперечний носовий валик – зачаток кінчика носа. Зовнішні носові отвори виникають із нюхових ямок, а крила носа – з бічних носових відростків. Задня стінка первинної ротової порожнини прободається й з'єднується з кишкою. На внутрішніх поверхнях верхньощелепних відростків з'являються піднебінні відростки. Зростаючись, вони розділяють первинну ротову порожнину на властиво ротову й носову. У цей же час із матеріалу середнього лобового відростка утвориться носова перегородка. Краю піднебінних відростків зростаються між собою й нижнім краєм носової перегородки, внаслідок чого піднебіння здобуває остаточна будова. Зуби є похідними ектодерми (емаль) і мезенхіми (пульпа, дентин). Язик утвориться спочатку як виступ нижньої стінки кишки між щелепною (мандибулярною) і під'язиковою (гіоїдною) дужками.

Особливості стадій зародка і плода. Хоча стадії зародка і плода характеризуються значною кількістю розбіжностей, все ж їх можна згрупувати і виділити основні характерні риси цих періодів життя особини.

Перш за все слід зазначити, що на стадії зародка процеси розвитку за темпами та інтенсивністю помітно переважають процеси росту. В цей час активно відбуваються процеси диференціації, спеціалізації клітин, формування зачатків органів і самих органів та тканин, діють механізми ембріональної індукції, відбуваються клітинні переміщення тощо. При цьому розміри організму збільшуються менш інтенсивно у порівнянні з наступною стадією – плода. Так, восьмитижневий зародок має довжину близько 40 мм і масу близько 5 г. У період між 6-й і 8-й тижнями загальний вид зародка змінюється, намічаються риси особи й він починає виявляти більше подібності з людиною: відокремлюється шия, голова стає круглої, виникають зачатки зовнішнього вуха й носа. Очі змішаються з бічних поверхонь вперед й зближуються, з'являються повіки. Кінцівки стають довшими, чітко намічаються й оформляються всі їхні відділи.

Добре розвиваються пальці, особливо на руках. Хвіст майже непомітний. У передньому відділі мозку починається ріст більших півкуль. Відбувається подальша диференціація секреторних компонентів вторинної нирки. Первинна нирка в значній мірі дегенерує, але протягом частини зародкового періоду, очевидно, функціонують обидві нирки. Починається утворення наднирників. До 8-го тижня завершується диференціація зачатків гонад у чоловічі або жіночі полові залози, наприклад у перших уже чітко видні сім’яні канальці.

Внаслідок високої інтенсивності процесів диференціації і спеціалізації клітин, значної потреби більшості зачатків органів у індукуючих речовинах, зародок, порівняно із плодом, є більш вразливим до впливу зовнішніх факторів. Навіть незначні концентрації шкідливих речовин, потрапивши до зародку, здатні викликати порушення у диференціації клітин, у формуванні зачатків органів, у біохімічному складі і концентраціях індукуючи речовин, і, як наслідок, тяжкі патології подальшого розвитку і навіть загибель ембріону.

До кінця 8-й тижня завершується зародковий період розвитку. Практично всі основні структури й системи органів диференційовані. Плодовий період, що починається з 9-го тижня, характеризується ростом структур, їх подальшою диференціацією і початком функції формування.

Однак, порівняно з попереднім періодом розвитку, інтенсивність диферентних процесів на цій стадії починає поступатись інтенсивності росту, тобто збільшенню маси і розмірів зародка. Адже, починаючи з маси 5 г, в кінці періоду плід набуває маси 2500-4500 г, а то й більше. Крім того, внаслідок сформованості до цього періоду основи усіх органів і систем, то вплив негативних факторів зовнішнього середовища, хоча і може зашкодити повноцінному розвитку ембріона, вже не викличе таких тяжких наслідків, які могли б бути у попередньому періоді. Тобто, порівняно із зародком, плід є менш чутливим до впливу зовні.

Лекція № 5.

Дата добавления: 2014-01-05