Лекция 12. Подготовка проб для определения токсикантов

Развитие аналитической химии токсикантов в настоящее время идет по двум направлениям: разработка максимально селективных и чувствительных методов определения индивидуальных веществ (например, масс-спектрометрия высокого разрешения) и сочетание методов разделения и концентрирования с неселективными методами определения в комбинированных методах анализа, т.е. применение комбинированных методов. Далеко не всегда можно проанализировать образец без предварительного выделения определяемых соединений из природного объекта. При этом, как правило, возникает необходимость их концентрирования по отношению к матричным компонентам, присутствующим в растворе или в газовой фазе. Целью концентрирования является снижение нижнего предела обнаружения, тогда как разделение позволяет упростить анализ и устранить влияние мешающих веществ.

Хранение и предварительная подготовка проб. Ошибки, обусловленные хранением проб, содержащих следовые количества загрязняющих веществ, обычно связаны с адсорбцией определяемых компонентов на стенках сосудов или с их трансформацией в процессе хранения. Известно, например, что ПХДД, ПХДФ, ПХБ, ПАУ и ХОП, содержащиеся в пробах воды, адсорбируются стенками полиэтиленовых сосудов, а ионы тяжелых металлов из стекла переходят в воду. Для устранения ошибок такого рода рекомендуется применять сосуды с малой поверхностью. Процесс адсорбции во многом определяется природой следового и добавляемого компонентов, свойствами поверхности используемых сосудов и многими другими параметрами, поэтому общие правила рекомендовать достаточно сложно.

Пробы органических токсикантов часто более реакционноспособны, чем неорганические. Так, под влиянием примесей металлов при весьма низких температурах (меньше 10°С и даже ниже 0°С) из простейших и циклогексановых углеводородов могут образоваться ПАУ с малой, средней и относительно большой молекулярной массой. Повышение температуры (даже незначительное) нежелательно при хранении растительных и животных тканей, пищевых продуктов, почв и донных отложений, поскольку возникает реальная опасность получения искаженных результатов. Поэтому, как правило, образцы хранят при низких температурах, уменьшающих скорость указанных выше процессов.

Особые меры предосторожности необходимо соблюдать при хранении проб водопроводной воды, содержащей ПАУ в концентрациях порядка 1-3 нг/л. Установлено, что даже при 5°С при хранении проб хлорированной водопроводной воды 18 сут. многие из углеводородов исчезают практически полностью. Для устранения потерь ПАУ рекомендуется добавлять к каждой пробе сульфит натрия и хранить пробы в темноте, не переливая пробы из одной емкости в другую и т.п. При хранении проб сточных вод нефтехимических предприятий следует учитывать присутствие в воде диспергированных нефтепродуктов, в капельках и пленке которых растворяется основная часть ПАУ. Консерванты также могут искажать оезультаты. Так, для предотвращения коагуляции крови очень часто к ней добавляют ЭДТА, которая связывает тяжелые металлы.

Большие трудности при определении фоновых загрязнений окружающей среды токсикантами возникают в связи с тем обстоятельством, что уровни их содержания в природных объектах могут быть сравнимы с количествами этих соединений, вносимыми в образец с используемыми в анализе реагентами и из атмосферы.

Все реагенты, особенно применяемые в больших количествах, должны быть по возможности высочайшей чистоты. Для определения очень низких концентраций (одна часть на триллион и ниже) даже реагенты высокой чистоты перед применением необходимо очищать дополнительно. Поэтому реагенты следует выбирать не только исходя из их химических свойств, но и с точки зрения возможностей качественной очистки. Так, предпочтительны кислоты, которые можно перегнать при низкой температуре (НСl, НNО₃). Реактивы и растворы реагентов желательно хранить в контейнерах, снабженных распределителем для предотвращения загрязнения при введении пипетки. Следует избегать использования окрашенных пробок, поскольку пигменты могут содержать загрязняющие компоненты.

Материалы, из которых изготовлены сосуды, устройства и инструменты для отбора и подготовки проб, должны быть устойчивыми к действию образца или реагента. Их поверхность должна быть гладкой и легко очищаться. В этом отношении наилучшие свойства имеет посуда из тефлона, но он имеет зернистую структуру и может адсорбировать многие соединения, особенно при повышенных температурах.

Установлено также, что подготовленная для отбора образцов стеклянная и полиэтиленовая посуда через несколько часов накапливает загрязнения, адсорбируя их из воздуха лаборатории. Поэтому посуду необходимо обрабатывать непосредственно перед употреблением. В некоторых работах предлагается выдерживать стеклянную посуду перед использованием в течение 12 ч при 500°С. Не рекомендуется ополаскивать ее органическими растворителями. Чем ниже ожидаемая концентрация токсиканта, тем более тщательной должна быть очистка.

Необходимо учитывать особенности биопроб. Например, ноголетние эксперименты помогли разработать оптимальный вариант процедуры хранения образцов: 1 мл ледяной уксусной кислоты добавляют к 100 мл мочи. Это предохраняет ее от бактериального разложения, а величина рН (3,3-4,3) имеет значение, подходящее для большинства аналитических процедур. Однако при определении ртути мочу необходимо подкислять азотной кислотой до рН 1 и ниже.

При хранении проб слюны в первую очередь следует замедлить ее ферментативную активность, поскольку присутствующие в ней ферменты (амилаза, фосфатаза, эстеразы и пр.) могут повлиять на метаболические изменения определяемых компонентов. Чтобы избежать поглощения следовых количеств токсикантов стенками стеклянной посуды, слюну обычно хранят в склянках из фторопласта. Заметим также, что в слюне содержатся белковые вещества (альбумины, липопротеиды, глобулины и др.), поэтому необходимо принимать во внимание фактор связывания токсичных веществ белками.

В общем случае химическим или бактериальным превращениям биопроб способствует наличие воды. Поэтому в некоторых методиках перед хранением проб рекомендуется их сушка. Однако она необратимо изменяет биологический препарат. Так называемую сухую массу, как правило, применяют лишь для сравнения данных, полученных в разных лабораториях, поскольку при сушке на состав образца влияют температура, вид биологического материала и природа определяемых компонентов. Так, большая часть ртути теряется при сушке; то же наблюдается для мышьяка и селена. Более предпочтительна лиофилизация, в ходе которой биологический материал изменяется меньше.

Одно из важнейших условий подготовки образцов – гомогенизация, т.е. доведение образца до однородного состояния, т.е. достижение равномерного состава любой части образца.. Это размол, дробление, диспергирование, измельчение, смешение и т.п., поскольку уменьшение размера частиц сопровождается увеличением их поверхности и, соответственно, повышением скорости взаимодействия с реагентами.

Подготовка к анализу биологических образцов и пищевых продуктов также включает в себя гомогенизацию. Обычно ее проводят в миксерах с вращающимися ножами. Однако они являются главными источниками загрязнения биопроб, поскольку сильно истираются в процессе работы. Потери могут быть обусловлены и адсорбцией токсикантов на поверхности миксера, а также их испарением.

Помимо гомогенизации анализ биообъектов практически всегда предусматривает также их деструкцию, осаждение белков и удаление липидов. Простейшей и наименее загрязняющей процедурой является обработка проб разбавленными кислотами (хлорной, вольфрамовой, трихлоруксусной, сульфосалициловой). При рН<0,5 многие загрязняющие вещества (например, ионы тяжелых металлов) освобождаются от своих связей в биологическом материале. Эта методика применима как к жидким, так и к твердым образцам. Она имеет то преимущество, что большинство мешающих компонентов при этом выпадает в осадок и их можно отделить центрифугированием.

Если рассматривать проблему в целом, следует отметить, что в большинстве случаев процессы пробоподготовки заключаются в отделении определяемых компонентов из объекта или мешающих веществ таким образом, чтобы достигался максимальный эффект.

Заметим, что из всех операций пробоподготовки основная доля затрат приходится на процедуры по переводу проб в форму, удобную для анализа (растворение, разложение, перевод в другую фазу и т.п.), и отделению определяемых компонентов от мешающих веществ. При их выполнении пока преобладает ручной труд, что обусловливает высокую стоимость определений.

Жидкостная экстракция. Как уже отмечалось выше, методы разделения и концентрирования играют особую роль в анализе токсикантов. Среди распространенных на сегодняшний день методов разделения и концентрирования, видимо, одним из важнейших является жидкостная экстракция – распределение вещества между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Наиболее часто встречаются системы, в которых одной фазой является вода, а второй – органический растворитель. Кроме того, жидкостная экстракция не требует сложного оборудования и выполняется достаточно быстро в делительной воронке или автоматически при использовании экстракторов непрерывного действия. Высокая степень извлечения определяемых компонентов достигается также в перегонно-экстракционных устройствах (аппаратах Сокслета) при одновременной конденсации водяного пара и не смешивающегося с водой растворителя. Такие устройства применяют для концентрирования ПХБ и ХОП, ПАУ, фенолов и других соединений.

Несмотря на важность жидкостной экстракции и большое количество работ в этой области до сих пор выбор растворителя, пригодного для выделения определяемого соединения, осуществляется в основном эмпирически. Обычно выбирают систему с наивысшим коэффициентом распределения данного вещества. В порядке увеличения полярности органической фазы для облегчения подбора рекомендованы следующие системы растворителей: гексан (циклогексан)/этанол + вода < бензол/метанол + вода < хлороформ/метанол + вода < этилацетат/вода < бутанол-1 (бутанол-2)/вода и др. Предельные углеводороды, Являются самыми слабыми экстрагентами, сольватирующие полярные молекулы за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий с энергией ~ 1 кДж/моль. Непредельные углеводороды, как и ароматические, вследствие дополнительного p-взаимодействия являются более эффективными экстрагентами. Еще более высокой экстракционной способностью обладают хлорсодержащие углеводороды, образующие с экстрагируемыми соединениями водородные связи, причем дихлорметан и хлороформ обычно более эффективны, чем четыреххлористый углерод. Аналогично извлекают полярные молекулы спирты и эфиры, различная природа которых позволяет дифференцировать степень извлечения отдельных соединений.

Экстрагенты, применяющиеся для концентрирования микропримесей из воды, должны удовлетворять достаточно жестким требованиям: извлекать определяемое вещество или группу веществ с высоким коэффициентом распределения, иметь низкую летучесть (температура кипения не ниже 50°С) и растворимость в воде, а их плотность должна как можно больше отличаться от плотности раствора. Они не должны также взаимодействовать с компонентами исследуемой системы. В случае анализа следовых количеств суперэкотоксикантов жесткие требования предъявляются и к чистоте экстрагентов.

Жидкостная экстракция особенно удобна при извлечении из воды неполярных и малополярных веществ, присутствующих в водных растворах в неионизированной форме. В частности, она широко применяется для группового извлечения ПАУ. Одновременно достигается высокая степень их концентрирования и отделения от полярных (водорастворимых) веществ.Для извлечения ПАУ применяют неполярные или малополярные растворители. Хотя считается, что лучшие экстрагенты для ароматических соединений – это галоидсодержащие углеводороды (CCl₄, СНС1₃, СН₂Сl₂) и бензол, высокая эффективность при извлечении ПАУ достигается и в случае гексана (табл. 12.1). При этом соотношение объемов (V_в/V_o) редко превышает 10². Для проб с низким содержанием ПАУ достаточно 1-3 экстракций, а для сильно загрязненных сточных и подземных вод число повторных операций может составлять от 3 до 6.

Таблица 12.1 Характеристики методик экстракционного
выделения ПАУ из вод

Вода	Экстрагент	Vв / Vo, мл/мл	t, мин	п	R, %
Питьевая	Циклогексан	50/1000
Пластовая	Хлороформ	100/1000
Грунтовая	Гексан	200/1000			–
Пластовая, сточная	Тоже	3/100		3-4
Речная	Петролейный эфир	100/1000	–		–
Морская	Четыреххлористый углерод	5/1000	–
Сточная	Дихлорметан, бензол	100/3000

Степень извлечения определяемых компонентов может быть повышена за счет введения в водную фазу высаливателей или органических растворителей. В частности, при экстракции бенз(а)пирена диэтиловым эфиром к пробе воды добавляют хлорид натрия до насыщения. Исследования показали, что высаливающее действие соли повышается с ростом плотности заряда катиона. С применением высаливания извлекают также фенолы и их хлорпроизводные. Согласно теории, высаливание снижает растворимость органических веществ в воде. Количественно этот процесс описывается уравнением:

lg(D / P ₀)= KC,

где D – коэффициент распределения при экстракции вещества из солевого раствора; Р ₀ - коэффициент распределения при экстракции из водного раствора; К – константа высалнвания; С – молярная концентрация соли в водном растворе.

Обычно величина К не превышает 0,5. Кроме того, высаливатели заметно снижают влияние ПАВ, связывая последние в комплексные соединения.

Для концентрирования следовых количеств пестицидов при их определении в воде можно использовать органические растворители, находящиеся в фазе сетчатого сополимера стирола с дивинилбензолом. Осуществление экстракции в динамических условиях и высокая степень диспергирования органического растворителя в набухшем сополимере позволяют ускорить массоперенос вещества из водной фазы в органическую и достичь высоких коэффициентов распределения. С помощью динамического экстракционного концентрирования можно определять пестициды в подземных водах и водных источниках на уровнях на 3-5 порядков ниже принятых значений ПДК.

Для экстракции следовых количеств определяемых компонентов в большинстве случаев необходимо использовать специальное оборудование: специальные экстракторы, центрифуги, мешалки и т.д. Иногда для улучшения разделения одну из жидких фаз замораживают и отделяют фильтрованием.

Наряду с извлечением токсикантов из водных растворов экстракцию растворителями применяют для их выделения из биологических объектов, почв, донных отложений, пищевых продуктов. Главное, на что обращается внимание при выборе экстрагентов и условий экстракции, это избирательность и степень извлечения определяемых соединений. Экстрагент должен обеспечивать высокие значения фактора разделения макро- и микрокомпонентов, иметь достаточную емкость и быть селективным. В поисках лучших условий экстракцию осуществляют в аппаратах Сокслета при повышенной температуре с использованием смеси растворителей. Так, для извлечения диоксинов из проб почв последние обрабатывают смесью гексан-ацетон (4:1). Иногда применяют последовательную экстракцию несколькими растворителями, например смесью дихлорметана с циклогексаном, а после этого – гексаном и диметилсульфоксидом.

ФОП и ХОП из образцов растительного происхождения извлекают ацетонитрилом и ацетоном. Установлено, что для извлечения пестицидов из растений, содержащих большие количества восков и липидов, лучше применять ацетон, а для образцов с большим содержанием пигментов – смесь гексана с изопропиловым спиртом (1:1). При экстракции пестицидов из почв используют ацетон, метанол, этилацетат, ацетонитрил и хлороформ. Присутствующая в почвах вода, как правило, ослабляет силы адсорбционного удерживания пестицидов из-за процессов гидратации. Поэтому перед их извлечением почву рекомендуется хорошо увлажнить водой или обработать растворами кислот (щелочей). Поскольку при извлечении пестицидов в органический растворитель обычно переходят их гидратированные формы, то используют хорошо растворимые в воде растворители (метанол, ацетон, ацетонитрил и др.) или смеси с неполярными жидкостями, тогда как при экстракции из воды в основном применяются последние.

Твердофазная экстракция. Для выделения токсикантов из жидкостей и газов широко применяют также сорбционные и ионообменные процессы. В последнее время их объединяют понятием «твердофазная экстракция» («Solid-Phase Extraction»). Метод основан на специфических взаимодействиях выделяемого компонента с сорбентом при пропускании раствора через патрон со сравнительно малым количеством твердой фазы. В тех случаях, когда объект представляет собой многокомпонентную систему, требующую детального исследования, применение твердофазной экстракции (ТФЭ) позволяет провести фракционирование пробы. На последовательно соединенных патронах можно одновременно выделять и разделять соединения различных классов: органические и неорганические, полярные и неполярные, ионные и т.д. Такой подход обеспечивает более высокую степень автоматизации процесса пробоподготовки, поскольку процедура экстракции значительно упрощается.

В большинстве случаев концентрирующие патроны представляют собой разъемные капсулы из полиэтилена или фторопласта, заполненные гидрофобными сорбентами на основе силикагелей, полимеров или активных углей с привитыми алкильными, фенильными и нитрильными группами. Наряду с ними выпускаются также патроны для ионообменной ТФЭ, содержащие сорбенты с привитыми аминными, аммониевыми и карбоксильными группами. Если первые используются в основном для выделения нейтральных органических соединений, то вторые – для извлечения органических и природных кислот и оснований, а также катионов тяжелых металлов.

Одним из основных достоинств сорбционных патронов является более высокая скорость сорбции и десорбции, что позволяет работать при повышенных скоростях пропускания анализируемого раствора через слой сорбента, но сорбционная емкость сорбентов на основе химически модифицированных силикагелей заметно ниже, чем у их полимерных аналогов, хотя вполне достаточна для концентрирования микропримесей. Особенно важно это учитывать при анализе следовых количеств веществ, когда речь идет о соединениях с высокой токсичностью, канцерогенностью или способных накапливаться в живом организме, вызывая мутации.

Ионные соединения также могут быть сконцентрированы и очищены с помощью ТФЭ. В этом случае применяют патроны с анионо- и кати-онообменными сорбентами различной силы. В частности, разработана методика определения аминной соли 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в почвах, основанная на ее извлечении из 0,5 М раствора NaHCO₃ анионообменной мембраной. Однако следует учитывать, что десорбция определяемых компонентов при элюировании ионных соединений органическими растворителями бывает затрудненной и неполной, что ведет к отравлению ионита. Применение термической десорбции также ограничено из-за низкой устойчивости большинства ионитов при нагревании. Поэтому элюирование сконцентрированных соединений с ионообменных патронов обычно осуществляют водными или водно-органическими растворами с рН < рК_а – 2 (для кислот) и рН > рК_а + 2 (для оснований). При этих значениях рН либо сорбент, либо определяемые соединения нейтрализуются и последние извлекаются из патрона. Большое влияние на ионный обмен оказывает природа противоионов сорбента. Для катионообменных патронов в качестве противоионов предпочтительно использовать H⁺, NH₄⁺, Na⁺, Li⁺, а для анионообменных – СН₃СОО^–, НСО₃^–; реже используются Сl^–, NO₃^–, SO₄^2–.

Для ТФЭ ионов высокотоксичных металлов наряду с ионообменными сорбентами наибольший интерес в настоящее время представляют патроны, содержащие привитые комплексообразующие реагенты, которые образуют комплексы различной устойчивости с широким кругом ионов переходных металлов. Это позволяет при варьировании рН осуществлять их избирательное или групповое концентрирование. В качестве твердых основ для иммобилизации органических реагентов применяют кремнеземы, целлюлозу, активный уголь, сефадексы, полимеры линейного и сетчатого строения и др. В частности, концентрирование Pb, Cd, Zn и Ni из водных растворов осуществляют с помощью хелатного сорбента на основе амберлита XAD-2, содержащего ализариновый красный S. В работе показана возможность применения силикагелей с иммобилизованными карбоксильными группами для разделения и концентрирования одно- и двухзарядных катионов переходных металлов.

ТФЭ находит применение для селективного выделения из природных вод радионуклидов. В частности, сорбенты на основе ферроцианида кобальта эффективны для концентрирования ¹³⁴Cs и ¹³⁷Cs даже при анализе морской воды. Для извлечения радиоактивного стронция применяют ионообменники КУ-2 или импрегнированные краун-эфирами волокна. В общем случае применение сорбционных патронов для ТФЭ включает в себя следующие операции:

– активация патронов - промывка подходящими растворителями или их смесью (в случае ионообменных сорбентов применяют растворы электролитов и буферные смеси);

– кондиционирование - промывка патронов растворителем, в котором растворен препарат;

– пропускание анализируемого раствора;

– продувка патрона инертным газом (осушенным азотом) или промывка растворителем для удаления остатков анализируемого раствора;

– элюирование сконцентрированной пробы.

Необходимо учитывать, что при активации патронов смесями растворителей следует применять только те из них, которые смешиваются между собой. Кроме того, активирующий растворитель должен смешиваться с кондиционирующим растворителем. В противном случае между стадиями активации и кондиционирования вводят промежуточную операцию – промывку патрона небольшим количеством растворителя, хорошо смешивающегося с обоими агентами. Заметим также, что после активации или кондиционирования нельзя допускать высыхания патрона и попадания в него пузырьков воздуха. После кондиционирования патрон следует сразу же использовать для работы либо закрыть герметично заглушками с обоих концов. Определенные ограничения накладывает и выбор последующего метода анализа. При применении газовой хроматографии нельзя анализировать пробы, содержащие растворы солей и, в отдельных случаях, следы влаги. Если методом анализа является ВЭЖХ, то для элюирования определяемых компонентов нельзя применять растворители, не смешивающиеся с подвижной фазой.

Все растворители и растворы перед ТФЭ должны быть отфильтрованы на мембранном фильтре с диаметром пор ~ 0,5 мкм. Скорость пропускания пробы через патрон в большинстве случаев не должна превышать 5-10 мл/мин, а объем пробы 1000 мл. Объем элюирующего растворителя обычно составляет 1-5 мл. Желательно, чтобы элюент вводился порциями по 0,5 мл, причем первая порция задерживается в патроне на 1-2 мин для установления равновесия в системе и более полного извлечения сконцентрированных соединений. Как правило, растворы пропускают через патрон с помощью шприца, водоструйного насоса, подсоединенного к нижнему штуцеру, или за счет гидростатического давления (самотеком). В последнее время для этих целей применяют перистальтические насосы, позволяющие значительно облегчить работу по пробоподготовке.

Хроматографические методы. К хроматографическим методам разделения и концентрирования относят процессы распределения веществ между подвижной (жидкой или газовой) и неподвижной (твердой или жидкой) фазами, при этом чаще всего жидкая фаза движется в одном направлении относительно неподвижной фазы.. На применении хроматографии в настоящее время базируется большинство современных методов пробоподготовки и анализа токсикантов, особенно в случае следовых количеств. Среди них наибольшее распространение получила жидкостная хроматография, в основе которой лежит распределение вещества между неподвижной твердой и подвижной жидкой фазами. Существуют различные виды взаимодействий между разделяемыми соединениями и твердой фазой: адсорбция, ионный обмен, гель-фильтрация и др. В наиболее часто применяемой адсорбционной хроматографии разделение составных частей пробы достигается благодаря различной полярности органических веществ. При этом компоненты пробы адсорбируются на поверхности твердой фазы и удерживаются на ней благодаря образованию нековалентных (например, водородных или гидрофобных) связей или за счет сил Ван-дер-Ваальса. В ионообменной хроматографии из подвижной фазы на твердом ионообменнике сорбируются противоположно заряженные ионы (органические и неорганические), тогда как в гелъ-хроматографии в качестве твердой фазы применяются гели, содержащие поры определенного диаметра. Молекулы, размер которых больше диаметра пор, не могут проникнуть внутрь геля. Поэтому при прохождении подвижной фазы в первую очередь элюируются соединения с молекулами большого размера

Для выделения органических токсикантов из экстрактов применяют различные сорбенты: силикагель, кремниевую кислоту, оксид алюминия, флоризил(силикат магния), фосфат кальция, активный уголь, целлюлозу, полимерные смолы и др.

Экстракты, содержащие изучаемые вещества, очищают пропусканием через колонки с силикагелем, оксидом алюминия, активным углем и цеолитами. Силикагель и оксид алюминия служат для удаления преимущественно полярных соединений, а активный уголь с цеолитами – неполярных. В случае «грязных» проб (экстракты почв, донных отложений, сточных вод и др.) проводят предварительную очистку с помощью гельхроматографии, которая позволяет удалить многие высокомолекулярные соединения. Выбор растворителя для элюирования зависит от свойств сорбента.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) на силуфоле, бумаге и др. обеспечивает также выделение ПАУ из органического вещества почв, донных отложений, растительного материала. В практических исследованиях применяют подвижные фазы из смесей растворителей; для аэрозолей – смесь петролейного эфира и бензола в соотношении, а для почв и растений – сначала смесь бензола, этилформиата и муравьиной кислоты в соотношении, а затем смесь гептана, бензола и хлороформа в соотношении. При определении ПАУ в поверхностных водах в качестве подвижной фазы применяют смесь петролейного эфира, ССЦ и уксусной кислоты в соотношении. Различные соотношения растворителей подбирают таким образом, чтобы получаемая смесь имела определенную полярность и наилучшее разделение веществ.

Техника эксперимента в случае ТСХ достаточно проста. Каплю раствора, содержащего разделяемые вещества, наносят на пластинку. Край последней помещают в камеру с подвижной фазой, служащей проявителем. Исходная смесь, перемещаясь вслед за восходящим или нисходящим фронтом подвижной фазы, разделяется на ряд отдельных пятен, каждое из которых соответствует тому или иному анализируемому компоненту. При этом быстрее перемещаются хуже сорбирующиеся вещества. К достоинствам ТСХ относится также возможность двухмерной схемы разделения; пластинку последовательно обрабатывают двумя растворами, подаваемыми во взаимно перпендикулярных направлениях. По окончании разделения возможны самые разнообразные способы идентификации и определения выделенных веществ: от визуального обнаружения до точных измерений с помощью сканирующих денситометров.

Для эффективного выделения соединений, имеющих высокую полярность и соответственно хорошо растворяющихся в полярных растворителях, применяют ионообменную хроматографию. Однако заметная растворимость ионообменных смол в неводных растворителях является причиной появления фоновых сигналов и не позволяет анализировать следовые количества токсикантов. Заметим, что ионная хроматография достаточно широко применяется для выделения ионов токсичных металлов, прежде всего радионуклидов.

Разделение с помощью мембран и электрофореза. В отличие от хроматографии, которая имеет жесткие ограничения по количеству разделяемых веществ, мембранные методы, не давая преимуществ по избирательности, позволяют добиться большей производительности разделений. Принципиальной основой этих методов является способность веществ проникать через мембраны в зависимости от их молекулярной массы. При этом перенос вещества через мембрану может осуществляться тремя способами:

– молекулярная диффузия за счет градиента концентраций или температуры;

– электромиграция заряженных частиц в электрическом поле;

– перенос вещества под действием градиента давления.

Новые перспективы для применения мембран открывает недавно предложенный хроматомембранный метод разделения органических веществ, сочетающий преимущества парофазного анализа и мембранного концентрирован™. В случае реализации данного метода массообмен между жидкой и газовой фазами происходит в пористом блоке, состоящем из полимерного материала. При этом обеспечиваются высокая эффективность и непрерывный режим процесса.

Наряду с мембранными методами для разделения заряженных частиц или молекул можно использовать их различную подвижность в электрическом поле – зонный электрофорез. До настоящего времени описано лишь несколько случаев применения электрофореза в анализе токсикантов. Тем не менее этот метод вызывает в последние годы повышенный интерес, особенно его капиллярный вариант, поскольку в обычном зонном электрофорезе из-за конвекции раствора, вызванной его нагреванием при прохождении электрического тока, зоны размываются, и не происходит их разделения на узкие полосы. Для предотвращения размывания зон электрофорез проводят в капиллярных трубках.

Схема установки для капиллярного зонного электрофореза не требует особых пояснений (рис. 12.1). Капилляр, в котором перемещаются зоны компонентов образца, помещают между двумя сосудами с раствором, проводящим электрический ток (обычно применяют буферные растворы), и устанавливают между электродами разность потенциалов E = 20-30 кВ.

Основные параметры, описывающие процессы в капиллярах при электрофорезе, аналогичны хроматографическим: время миграции частицы t = L²/m E (L – длина капилляра) и эффективность разделения, измеряемая числом теоретических тарелок N = m E /2 D (D – коэффициент диффузии определяемого компонента, a m –электрофоретическая подвижность). Видно, что эффективность разделения зависит от Е, тогда как L практически не влияет на нее и определяет лишь время миграции зоны в капилляре. Для повышения производительности обычно повышают напряжение и уменьшают длину капилляра. Однако с уменьшением L понижается сопротивление раствора, что способствует более интенсивному выделению тепла. Тепловые эффекты сводят к минимуму путем охлаждения капилляра. Объем инжектируемого раствора также стараются взять минимальным. Для лучшего разделения концентрация буферного раствора должна быть примерно в 1000 раз выше концентрации определяемых веществ.

Электрод Электрод

Рис. 12.1. Схема установки для капиллярного зонного электрофореза

Заметим, что успех разделения во многом зависит от состава буферного раствора. Наиболее часто применяют фосфатные буферы с рН ~ 7,0 и концентрацией 0,01-0,05 моль/л. Небольшие значения ионной силы и высокие значения рН обеспечивают оптимальную скорость движения зон в капиллярах. Иногда для повышения эффективности разделения сложных смесей (белки, сыворотка крови и др.) капилляры заполняют гелями. Присутствие последних сводит к минимуму диффузионный вклад в размывание зон. Кроме того, гели уменьшают адсорбцию частиц разделяемых веществ на стенках капилляров и практически устраняют электроосмос, что особенно важно в случае коротких капилляров. Чаще всего используют гели из полиакриламида, содержащего додецилсульфат натрия.

К образованию «хвостов» может привести и взаимодействие разделяемых компонентов со стенками капилляра (электростатическое, вследствие адсорбции и др.). Его устраняют добавлением к буферным растворам солей, участвующих в конкурентной адсорбции с определяемым веществом, либо использованием специальных покрытий внутренних стенок капилляра инертными материалами. Высокая эффективность разделения при относительно малом объеме анализируемого раствора и простота аппаратуры явились причинами того, что капиллярный зонный электрофорез широко применяется в настоящее время для определения биологически активных веществ, в том числе белков, токсинов, ядохимикатов и продуктов их метаболизма, в растительных и животных тканях.

Упаривание и дистилляция. При определении токсикантов после стадий разделения и концентрирования практически всегда возникает необходимость упаривания раствора с целью уменьшения его объема. Упаривание применяют даже тогда, когда оно может служить источником погрешностей, например, для концентрирования в связи с низкой чувствительностью метода анализа. Чаще всего для этих целей применяют специальные приборы, например Кудерны-Даниша, которые позволяют упарить раствор до нескольких миллилитров при минимуме потерь, или роторные испарители. Последние заметно интенсифицируют процесс испарения. Дополнительно применяют отгонку при низком давлении или лиофильное высушивание, если существует опасность высокотемпературной деструкции.

Следует заметить, что при определении токсикантов в следовых количествах упариванию должны подвергаться только низкокипящие растворители (дихлорэтан, хлористый метилен, метанол, гексан и др.). Иногда к ним добавляют растворители с более высокой температурой кипения (0,5-1%), которые смачивают стенки перегонной колбы и способствуют удерживанию следового компонента в растворе благодаря предотвращению его необратимой сорбции на ее стенках.

Растворы веществ с низкой летучестью можно упаривать досуха. Такая операция должна производиться при возможно более низкой температуре, а нагревание следует осуществлять расположенным сверху источником тепла, например инфракрасной лампой. При этом в качестве сосудов для упаривания лучше всего применять небольшие конические колбы. Упаривание пробы досуха также применяется при необходимости замены растворителя для последующих стадий анализа либо при последующей экстракции определяемых компонентов другим растворителем.

Полезный метод отделения следовых количеств веществ представляет перегонка с паром (кодастилляция). Этот метод, главным образом перегонка с водяным паром, используется, в частности, для разделения соединений на группы, например для отделения летучих веществ от нелетучих (белков, жиров и т.п.) и выделения следовых количеств ХОП из природных вод. Предварительно следует выяснить, не разрушается ли определяемое вещество при температуре отгонки. В противном случае следует применять отгонку с паром при пониженном давлении. Отогнанные соединения обычно извлекают из конденсата жидкостной экстракцией. Иногда применяют перегонку с другими растворителями (метанол, циклогексанон и т.п.). В другом варианте добавляют растворитель, кипящий при сравнительно низкой температуре, но с которьм совместно отгоняются определяемые компоненты, например дихлорметан.

Пробоподготовка при определении высокотоксичных тяжелых металлов и радионуклидов. Основнымипроцедурами пробоподготовки являются минерализация, окисление, фильтрация, центрифугирование, экстракция, ионный обмен и др. Выбор операции зависит от природы препарата, типа и концентрации определяемого элемента, метода его определения. Единственный метод, практически не требующий пробоподготовки (за исключением упаковки пробы в контейнер), - это нейтронно-активационный анализ.

Проблема пробоподготовки при определении тяжелых металлов и радионуклидов осложняется еще и тем, что химические элементы в природе испытывают постоянные превращения под воздействием кислорода, воды, солнечного облучения, микрофлоры и микрофауны.

Fe Pb Mn Cu Zn Ni Cr Cd Co

Рис. 12.2. Отношение концентраций растворенных форм металлов к их общему содержанию в воде р. Рур.

Диаграмма на рис. 12.2 иллюстрирует соотношение растворенных форм металлов и их общее содержание в речной воде. Видно, что существенная доля свинца переносится во взвешенном состоянии, а кадмий мигрирует преимущественно в растворенной форме. Без знания форм существования ионов металлов в природных средах невозможно оценить степень их токсичности. Поэтому при выборе методов пробоподготовки необходим тщательный контроль за любым воздействием на анализируемый объект: температуры, давления, окислителей и восстановителей, растворителей. Операция пробоподготовки, если речь идет об определении различных состояний и форм элементов, не должна видоизменять исходные формы либо они должны быть воспроизводимы.

Простейшей и наименее загрязняющей процедурой пробоподготовки является обработка пробы разбавленными кислотами. При значениях рН < 0,5 ряд элементов (Pb, Cd, Zn и др.) в основном освобождается от своих связей и может быть определен методом атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС) в пламенном или электротермическом вариантах, если чувствительность и селективность определений достаточны, а компоненты препарата не оказывают заметного влияния. Эффективность такой обработки всегда нужно контролировать, поскольку многие образцы не полностью растворяются в разбавленных кислотах. Кроме того, следует учитывать, что при пламенном варианте ААС органическое окружение элемента может давать свой вклад в аналитический сигнал и, следовательно, приводить к ошибочным результатам (если градуировка сделана для водных растворов солей). Если концентрация металлов слишком низка, то прибегают к обогащению пробы. Обычно к раствору добавляют комплексообразователи и экстрагируют комплексы определяемых элементов растворителями, не смешивающимися с водой. При этом все ионы, не образующие комплексных соединений с комплексообразователем, остаются в водной фазе. Указанный способ часто применяют в электротермическом варианте ААС, поскольку щелочные и щелочноземельные металлы создают помехи при определении тяжелых металлов в графитовой печи.

Еще одной процедурой при пробоподготовке природных образцов является минерализация, т. е. перевод соединений в неорганическую форму. Для этого необходимо полное удаление органических компонентов; постоянство содержания определяемых элементов; нахождение ионов в химической форме, пригодной для определения данным методом.

Если первое требование выполнить легко, то два других - довольно трудно, если вообще возможно. Из-за летучести элементов или их соединений, образования нерастворимых осадков, адсорбции ионов на поверхности сосуда неизбежно будут возникать потери. Кроме того, когда речь идет о низких количествах веществ, загрязнение образцов из посуды и окружающей среды лаборатории вносит искажения в результаты анализа.

В принципе известны два основных способа минерализации: сухое озоление и мокрая минерализация. Метод пробоподготовки с применением сухого озоления, сжигания и горения в кислороде довольно прост, и его предпочитают влажным методам, но он применим не ко всем образцам и зачастую приводит к потерям из-за улетучивания элементов при сжигании. Как правило, его не применяют при анализе следовых количеств элементов либо осуществляют минерализацию в закрытой системе, где кислород - единственный реагент. Образующийся осадок легко растворяется в разбавленных минеральных кислотах.

Мокрая минерализация – это окислительное разложение пробы с использованием соответствующих реагентов, от которых и происходя главным образом загрязнения. Потери при мокрой минерализации определяются летучими соединениями и в меньшей мере обусловлены образованием нерастворимых веществ. Обычно используют три группы реактивов: окислители (НNOз, H₂O₂, НClO₄ и др.), солюбилизаторы (H₂SO₄, НС1, NH₄OH) и катализаторы (H₂SO₄, Fe²⁺, Ag⁺).

Минерализацию биоматериалов лучше выполнять в две стадии: сначала образец гидролизуют разбавленной кислотой при температуре < 90 °С, а затем испаряют воду до тех пор, пока концентрация окислителя не станет достаточной для окисления органической составляющей. При необходимости добавляют концентрированный окислитель.

Общие подходы к пробоподготовке при определении токсикантов. Таким образом, пробоподготовка при определении токсикантов, особенно в следовых количествах, нужна а) для концентрирования образцов и отделения мешающих веществ б) для подготовки пробы к анализу, причем таким образом, чтобы последний был достоверен и воспроизводим во времени. Операции пробоподготовки не должны изменять исходные компоненты.

Принципиально такие схемы рассчитаны на идентификацию и определение различных форм загрязнителей, о которых нет информации к началу проведения анализа. Поэтому они основаны на щадящих методах пробоподготовки. По мере выяснения природы загрязнителей и состава пробы физико-химическое и/или химическое воздействие на пробу может нарастать. Так, полярность молекул изменяют путем превращения их в менее полярные производные, что повышает летучесть соединений. В других случаях вводят хромофорные группы или электрофильные группировки для последующего определения методами спектрофотометрии или вольтамперометрии. В принципе химическую модификацию определяемых соединений можно осуществлять на различных стадиях представленных выше схем: 1) до выделения компонентов из смеси; 2) в процессе выделения, например, непосредственно в хроматографической колонке; 3) после выделения из объекта.

Каждый из перечисленных вариантов имеет свои преимущества и недостатки. Успех модификации во многом зависит от конструкции реакторов: трубчатых, капиллярных, слоевых и др. В этом устройстве пестициды на основе N-метилкарбаматов гидролизуют до метиламинов раствором гидроксида натрия в реакторе, представляющем собой нагретую до 100°С стеклянную спираль длиной 3 м. При взаимодействии метиламинов с о-фталевым альдегидом и 2-меркаптоэтанолом образуются флуоресцирующие производные, которые регистрируют соответствующими детекторами.

Рис. 12.3. Схема пробоподготовки при определении суперэкотоксикантов
в твердых образцах

Рассмотренные особенности и методы пробоподготовки при определении токсикантов в природных объектах позволяют сделать вывод о необходимости серьезных исследований в этой области. Именно пробоподготовка в большинстве случаев является наиболее слабым звенoм в общей схеме анализа и лимитирует качество получаемых аналитических данных (рис. 12.3). Появление современных устройств пробоподготовки (автосамплеры, сорбционные патроны, сверхкритические экстракторы, системы ПИА и др.) позволяет автоматизировать многие процессы. Однако в конечном итоге надежность аналитической информации во многом зависит от умения и квалификации аналитика

Дата добавления: 2014-01-05