Осаждение белков

Растворы белков в воде.

Белки образуют в воде особую форму растворов – растворы высокомолекулярных соединений. Размеры белковых частиц придают им свойства коллоидных соединений. Белки в организме находятся в коллоидном состоянии. Имея большой размер молекулы – 0,001-0,1 мкм, белки не проходят через полупроницаемые перегородки, какими являются клеточные мембраны. Этим пользуются для очистки растворов белка от остатков низкомолекулярных веществ (солей, сахаров) при изготовлении иммунных сывороток, сухой плазмы, γ-глобулина и других препаратов. Метод такой очистки белков получил название – диализ. Явление диализа лежит в основе действия аппарата «искусственная почка», который широко используется в клиниках для лечения почечной недостаточности. Для коллоидных растворов характерна способность преломлять луч света, что используется для количественного определения белка методом рефрактометрии.

Амфотерность белков.

Благодаря наличию в белках аминных и карбоксильных групп, они в кислой среде диссоциируют как основания, а в щелочной – как кислоты. Амфотерные свойства белков обусловливают их значение как буферных систем (белковая буферная система), поддерживающих постоянство реакции среды в тканях, их участие в регуляции рН крови.

а) обратимое – (высаливание) путем добавления солей щелочноземельных металлов. В основе действия лежит конкуренция их с белками за воду. Высаливающий эффект наступает при достаточно высоких концентрациях солей (насыщенные или полунасыщенные растворы). В практике часто используют Nа₂SО₄ и (NН₄)₂SО₄. эти соли удаляют водную оболочку и снимают заряд. Глобулины, имеющие крупные и тяжелые молекулы и небольшую водную оболочку, выпадают в осадок при неполном насыщении раствора солями, а альбумины как более мелкие молекулы, окруженные большой водной оболочкой – при полном насыщении. Высаливание не вызывает нарушения структуры белков.

б) необратимое осаждение связано с нарушением пространственной структуры, что приводит к потере свойств (денатурация).

Денатурация – нарушение пространственной структуры белковой молекулы. При этом белок теряет все свои биологические и физико-химические свойства. Факторы вызывающие денатурацию:

· нагревание, облучение, охлаждение,

· механическое встряхивание, химическое воздействие;

Первичная структура белка при денатурации не изменяется, что создает возможность восстановления функций и структуры белка (в большинстве случаев денатурация необратима). В лабораторной практике денатурация используется для депротеинизации биологических жидкостей. Денатурация белков положена в основу лечения отравлений тяжелыми металлами, когда больному per os вводят молоко или сырые яйца с тем, чтобы Ме, денатурируя белки молока и яиц, адсорбировали их на поверхности Ме и не действовали на белки слизистой оболочки желудка и кишечника, а также не всасывались в кровь.

Изопротеины - белки с одинаковыми функциями, но отличающиеся физико-химическими свойствами.

Например, фермент-белок лактатдегидрогеназа (ЛДГ), состоит из 4-х субъединиц, формируется из 2-х генетически детерминированных полипептидных цепей «Н» и «М». Их разные комбинации позволяют создать 5 ферментов-белков, катализирующих одинаковую реакцию в разных органах и тканях. Это имеет важное значение для диагностики различных заболеваний.

Уровни структурной организации белковой молекулы

Белки имеют сложную пространственную структуру. Исследователи выделили 4 уровня организации.

Первичная структура – понятие, обозначающее последовательность аминокислотных остатков в белке. Например,

S S

Глу-Глун-Цис-Цис-Ала-Сер-Вал-Цис-Сер-Лей

(фрагмент одной из цепей молекулы инсулина)

Пептидная связь – основной вид связи, определяющий первичную структуру, она является ковалентной связью. Возможно и присутствие дисульфидных связей между двумя остатками цистеина в одной полипетидной цепи с образованием цистина.

Последовательность аминокислот в белке уникальна и детерминируется генами. Даже небольшие изменения первичной структуры могут серьезно изменять свойства белка. Первичная структура белков обеспечивает формирование последующих уровней структурной организации и определяет видовую специфичность белка.

Расшифрована первичная структура ряда ферментов: рибонуклеазы (129 аминокислот), карбоксипептидазы (309 аминокислот), некоторых гормонов. В последние годы внимание исследователей привлекают пептиды, состоящие из небольшого числа аминокислот и обладающие высокой биологической активностью. Гормон окситоцин (9 аминокислот) стимулирует сокращение гладкой мускулатуры (матки, молочной железы, кишечника). Гормон вазопрессин (9) – антидиуретический гормон, повышает кровяное давление, увеличивает реабсорбцию воды в почках. Недостаток его приводит к развитию несахарного диабета, при котором выделяется больше 10 л мочи в сутки, сильно разбавленной. Гормон инсулин контролирует содержание глюкозы в крови.

Определенный интерес представляет группа пептидов – энкефалины, которые вырабатываются в клетках ЦНС в ответ на болевые раздражения и ослабляют чувство боли. Так же обнаружены пептиды целенаправленного действия сна, жажды и т.д.

Вторичная структура – упорядоченная и компактная упаковка полипептидной цепи в пространстве. Она бывает в виде спирали и складчатой структуры. Образование вторичной структуры обеспечивается водородной связью, нековалентной. α-спиральную конфигурацию поддерживают, в основном, водородные связи внутри полипептидной цепи, β-структура полипептидной цепи имеет зигзагообразную структуру, полипептидные цепи уложены параллельно друг другу в виде складчатого слоя. В β-конфигурации отсутствуют внутрицепочечные водородные связи, а имеются межцепочечные водородные связи между пептидными группами соседних полипептидных цепей. Вторичная структура способствует компактизации полипептидной цепи, укладывая ее в α-спираль или β-структуру, тем самым определяя такие свойства как прочность, нерастворимость.

Вторичная структура детерминирована размером, формой и полярностью боковых радикалов аминокислот полипептидных цепей. Вторичная структура характерна для альбуминов, глобулинов, кератина волос, коллагена сухожилий.

Третичная структура – расположена в пространстве всей полипетидной цепи, содержащей α-спирали, β-структуры. Большая часть белков на уровне этой структуры принимает глобулярную форму. Основу составляют ионные связи, электростатические, в некоторых белках – ковалентные дисульфидные связи, которые стабилизируют третичную структуру. Третичная структура обеспечивает выполнение белком его основных функций. Глобулярные белки – альбумины и глобулины, обнаружены в крови и многих органах, фибриллярные – основа мышечных тканей. Характер третичной организации устанавливают с помощью рентгеноструктурного анализа.

Третичную структуру принято называть «нативной конформацией», т.е. нативные свойства белков (естественное состояние) определяются третичной структурой. При разрыве связей, стабилизирующих третичную структуру, белок теряет частично или в полной мере биологические и функциональные свойства.

Четвертичная структура – возникает в результате объединения нескольких субъединиц с третичной структурой в одну большую молекулу. Связь между субъединицами нековалентная, хотя в ряде белков субъединицы соединены ковалентными дисульфидными мостиками. Четвертичная структура обеспечивает кооперативный эффект, например молекула гемоглобина состоит из 4 субъединиц (степень α-спирализации составляет 80%, т.е. наибольшую), каждая из которых способна присоединять молекулу кислорода. При этом связывание кислорода одной субъединицей изменяет конформацию других субъединиц таким образом, что присоединение кислорода к ним облегчается – это совместный (кооперативный) эффект.

Фермент ЛДГ – 4 субъединицы: 2Н и 2М. их разные комбинации позволяют создать 5 ферментов, катализирующих одинаковую реакцию в разных органах и тканях: НННН, НННМ, ННММ, НМММ, ММММ. Такие белки называются – изопротеины или изоферменты. Изоферменты имеют различную локализацию в тканях. Это имеет важное значение для диагностики различных заболеваний.

Высшие уровни структуры молекулы белка обусловлены в основном особенностями первичной структуры, но в значительной мере зависят также и от условий среды, в которой находится белок (рН, tº).

Дата добавления: 2014-01-05