Методы выделения и очистки белков

ХИМИЯ БЕЛКОВ

Белки - высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки называют также протеинами (от греч. рrotos – первый). Свое название они получили, когда в тканях животных и растений были обнаружены вещества, имеющие сходство с белком куриного яйца.

Белки составляют основу и структуры, и функций живых организмов. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, поэтому они могут образовывать порядка 10¹⁸ разнообразных белков. Они обеспечивают существование около 10⁶ видов живых организмов, начиная от вирусов и заканчивая человеком. Каждый организм характеризуется уникальным набором белков.

Содержание белков в различных тканях одного организма неодинаково. Так, в организме человека содержится белков в % от сухой массы: в мышцах – 80,в мозге – 45, в костях – 20.

Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество: С - 50-54%; Н - 6,5-7,3%; О - 21-23%; N - 15-17%; S - до 0,5%.

В составе некоторых белков в небольших количествах содержатся фосфор, железо, марганец, магний, йод и др.

Содержание азота относительно постоянно во всех белках (около 16%), поэтому по содержанию белкового азота можно определять количество белка в биологических объектах.

Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации - теряют некоторые нативные (природные) свойства, например, растворимость, биологическую активность. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы.

Процесс начинают с гомогенизации биологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».

Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.

Для фракционирования и очистки белков используют следующие методы.

Высаливание – осаждение белков из раствора при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. Этот метод используется в клинической практике при анализе белков сыворотки крови, например, для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении).

Электрофорез основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови.

Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.

Хроматография (от греч. chroma – цвет) - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент).

Различают следующие разновидности хроматографии:

- адсорбционная - разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте;

- распределительная - твердая фаза служит опорой для стационарной жидкой фазы. Разновидностью является хроматография на бумаге;

- ионообменная - используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки;

- гель-хроматография, или метод молекулярных сит, основан на способности небольших молекул проникать в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки. Позволяет разделить белки с разной молекулярной массой.

Перспективными видами хроматографии являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и г азовая хроматография. Хроматография является одним из основных методов биохимических исследований. В клинических лабораториях ее применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.

Дата добавления: 2014-01-05