Определение каталазы по А.Н. Баху и А.И. Опарину

Сопоставление редокс-потенциалов рибовлавина и метиленового синего.

Обнаружение дегидрогеназы (ксантиноксидаза, альдегиддегидрогеназа, КФ 1.1.3.22) в молоке (реакция Шардингера).

В три пробирки наливают по 2 мл свежего коровьего молока. Одну пробу кипятят в течение 2 - 3 мин и охлаждают. В прокипяченную пробу и в одну из некипяченых проб добавляют по 0,5 мл 0,4%-ного раствора формальдегида, а в другую некипяченую - 0,5 мл воды. Затем во все три пробирки приливают по 2 капли 0,01%-ного раствора метиленового синего. Содержимое пробирок перемешивают и заливают в каждую по 3-4 капли вазелинового масла. Все пробы помещают в водяную баню при 40°С. Через некоторое время жидкость в некипяченой пробе, содержащей субстрат, обесцвечивается за счет образования восстановленной формы метиленового синего:

Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть на воздухе, то он вновь приобретает синий цвет:

Эту реакцию можно использовать для отличия сырого молока от кипяченого.

Редокс-потенциалы являются мерой способности молекул обмениваться электронами. Вещество с большим окислительно-восстановительным потенциалом окисляет вещество с меньшим окислительно-восстановительным потенциалом. Для метиленового синего (±2 е) Е'_о составляет +0,011 В, у НАД+ (±2 е) - 0,320 В, у рибофлавина (±2 е) - 0,208 В, у цитохрома с (±е) + 0,260 В. Сравнивая стандартные редокс-потенциалы этих систем, можно заключить, что метиленовый синий пригоден для выявления восстановленных форм никотинамидных и флавиновых оксидоредуктаз.

В пробирку наливают 5 - 6 капель воды, 1 каплю раствора рибофлавина и добавляют по каплям раствор метиленового синего до появления зеленовато-синего окрашивания смеси. Бросают в окрашенную смесь кусочек цинка и капают 1 каплю конц. соляной кислоты. Выделяется водород, происходит восстановление метиленового синего и рибофлавина. Восстановление первого из них происходит быстрее, поэтому цвет смеси становится сначала зеленым, затем зеленовато-желтым и наконец бледно-желтым или розоватым. Жидкость сливают в другую пробирку и наблюдают за изменением цвета. Восстановленная форма рибофлавина через метиленовый синий передает электроны и ионы водорода на кислород воздуха и раствор желтеет. После этого происходит окисление лейкометиленового синего, и содержимое пробирки меняет цвет через зеленый в синий.

Для определения берут водную вытяжку из моркови, которая содержит фермент каталазу. В коническую колбу вносят пипеткой 25 мл 0,1 н. раствора пероксида водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин действие фермента прекращают прибавлением 5 мл 10% раствора серной кислоты и титруют смесь 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания).

Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл). К этому раствору после охлаждения добавляют 25 мл 0,1 н. раствора пероксида водорода. Смесь оставляют стоять на 30 мин, после чего добавляют 5 мл 10% раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия.

По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчет количества пероксида водорода, разложенного ферментом, ведут в соответствии с уравнением реакции:

5Н₂О₂ + 2КМпО₄ + 3H₃SO₄ ® 2MnSO₄ + K₂SO₄ + 5О₂ + 8Н₂О,

согласно которому 1 мл 0,1 н. раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.

Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной - 30,2 мл 0,1 н. раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 - 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7 - 1,7) 24,99 мг. В 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное за 30 мин разложить

99,96 мг пероксида водорода, а за 1 мин – (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.

Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют ферменты класса оксидоредуктаз?

2. Рассмотрите роль дегидрогеназ в процессах биологического окисления.

3. Для опыта 3 составьте схему переноса водорода (электронов и ионов водорода) с учетом стандартных окислительно-восстановительных потенциалов использованных компонентов.

Дата добавления: 2014-01-05