Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Методы культивирования клеток и тканей

В условиях лаборатории можно культивировать самые разнообразные клетки одноклеточных и многоклеточных организмов, что совершенно необходимо для решения целого ряда цитологических проблем.

Культивирование клеток и тканей вне организма (in vitro) связано с соблюдением определенных условий, необходимых для роста и развития этих культур. Прежде всего требуется подходящая для каждого вида культур посуда. Так, культуры бактерий и простейших обычно содержатся в пробирках, чашках Петри и Коха, в стеклянных флаконах, микроаквариумах. Предметные стекла с углублениями (лунками), чашки и флаконы Карреля используются. Для культур тканей многоклеточных организмов. Выращивание культур производится на минеральных и питательных средах, состав которых различен для отдельных видов бактерий, простейших, а также для клеток и тканей многоклеточных животных и растений. Культуры бактерий успешно растут в жидких, в полужидких и на плотных питательных средах. Большое разнообразие культуральных сред известно и для простейших. Например, инфузория-туфелька -- обычный объект для многих цитологических работ - хорошо культивируется на сенном настое, настое салата, на минеральной среде Л.К. Лозина-Лозинского с постоянной подкормкой бактериями и дрожжами. Культуры амеб (Amoeba proteus) выращиваются на минеральной среде Прескотта с кормлением их мелкими инфузориями тетрахименами, а для культур разнообразных паразитических простейших существует много видов специальных сред, часто имеющих сложный состав.

Сложность состава характеризуется и большинство сред, используемых для выращивания тканевых культур. Например, синтетическая среда 199, наиболее широко применяемая сейчас для культивирования самых различных тканей, содержит свыше 60 компонентой (аминокислоты, витамины, источники липидов, компоненты нуклеиновых кислот и прочие вещества).

Культуры бактерий, простейших и тканевые культуры выращиваются при определенной температуре. Если кусочки тканей взяты от теплокровных животных, то тканевые культуры содержатся при 37° С. При этой же температуре культивируются многочисленные виды бактерий и паразитических простейших, живущих в организме человека и теплокровных животных. Свободноживущие простейшие, паразитические простейшие из холоднокровных животных, а также клетки растений можно успешно выращивать при комнатной температуре.

Вся посуда, инструменты, все минеральные и питательные среды, используемые для культур, должны быть стерильными. Загрязнение культур какими-либо посторонними частицами и бактериями из воды, воздуха и т. п. совершенно недопустимо. В относительно нестерильных условиях содержатся только культуры свободноживущих простейших. Однако в последнее время получен ряд культур инфузорий и жгутиконосцев, которые носят название безбактериальных и требуют не меньших условий стерильности, чем тканевые культуры.

Еще одно необходимое условие для поддержания любой культуры - это регулярные пересевы на свежую питательную среду. При условиях регулярных пересевов культуры бактерий, простейших и тканевые культуры могут существовать в течение многих лет.

Целый ряд цитологических исследований необходимо проводить на генетически однородном материале. С целью получения таких генетически однородных культур широко используется выведение клонов (клоновые культуры), представляющих потомство одной особи бактерий, простейших пли одной клетки какой-либо ткани.

Методы культивирования бактерий и простейших относительно просты; наибольшей сложностью характеризуются методы культивирования тканей. Среди них различаются культуры кусочков органов, кусочков тканей и отдельных клеток, выделенных из многоклеточного организма. Методика культивирования кусочков тканей разнообразна, но наиболее широко распространено культивирование в висячей капле и в чашке или флаконе Карреля.

В последнее время хорошо разработаны методы получения однослойных клеточных культур. Для таких культур небольшое количество клеток, полученных путем специальной обработки кусочков тканей, переносят в сосуды для культивирования и добавляют туда питательную среду. Клетки через небольшой промежуток времени прикрепляются к дну и стенкам сосуда, а затем начинают интенсивно размножаться, располагаясь в один слой. К настоящему времени получено несколько десятков клеточных штаммов, ведущих свое начало от разных тканей: соединительной, эпителиальной и др. Культуры таких клеток обладают определенными свойствами, сохраняющимися на протяжении многих клеточных поколений. Клетки из этих однослойных культур хорошо изучены, для них разработаны стандартные условия культивирования, и они представляют очень ценный материал при изучении клеточного обмена, потребностей клеток в тех или иных веществах, для исследований клеточных ядер, для прижизненных наблюдений и т. д.

 

4. Методы исследования биоэлектрических явлений в клетке.

Биоэлектрические потенциалы или электрические напряжения в тканях и клетках животных и растений могут быть измерены и засняты на движущуюся фотопленку. Для отведения биоэлектрических потенциалов из клетки пользуются двумя методами:

1) внутриклеточное отведение с помощью микроэлектродов;

2) внеклеточное отведение с использованием наружных электродов. Рассмотрим кратко оба эти метода.

Микроэлектроды, которые используются для внутриклеточного отведения электрических потенциалов,-- это микропипетки из стекла, заполненные раствором соли -- электролитом (2,5-3 М КCI). Кончик микроэлектрода, вводящийся в клетку, очень тонкий; его диаметр меньше 1 мк. Микроэлектроды вводятся в клетку при помощи микроманипулятора. Противоположный конец микроэлектрода соединяется со стеклянной трубочкой, заполненной агар-агаром желеобразной консистенции (агар-агар приготовлен на растворе Рингера). Стеклянная трубочка, в свою очередь, соединяется с неполяризующимся хлорсеребряным или каломельным электродом, а последний -- с регистрирующим устройством. Второй электрод (наружный) помещается во внешнюю среду, которая окружает клетку. Это стеклянная трубочка, заполненная солевым раствором. Она соединяется одним концом с неполяризующимся электродом, а последний -- с регистрирующим устройством.

Для внеклеточного отведения биопотенциалов к наружной поверхности клеток прикладываются два электрода. Это либо стеклянные трубочки, наполненные раствором Рингера, либо металлические проволочки (серебряные или платиновые). Они соединяются с неполяризующимися хлорсеребряными или каломельными электродами, а они, в свою очередь, с регистрирующим устройством.

Измерение биоэлектрических потенциалов можно производить как на клетках различных тканей многоклеточных организмов, так и на клетках простейших. Метод внутриклеточного отведения с применением микроэлектродов используется главным образом для регистрации разницы потенциалов, которая существует между клеткой и окружающей средой (потенциалы покоя). Внеклеточное отведение позволяет также регистрировать потенциалы, возникающие при повреждении и возбуждении (потенциалы повреждения и возбуждения). В целом же регистрация электрических процессов в клетках, тканях и органах - важный метод характеристики их функционального состояния.

5. Методы исследования физико-химических свойств клетки:

1. О вязкости клеточного содержимого, которое дает представление об агрегатном состоянии цитоплазмы и ядра, можно судить по скорости падения зерен крахмала в цитоплазме некоторых растительных клеток, по скорости перемещения ядрышка под влиянием силы тяжести, по скорости перемещения капельки масла, введенной в нервное или мышечное волокно, по скорости перемещения металлической частицы, введенной в клетку в магнитном поле, и по броуновскому движению, обычно наблюдаемому во многих растительных и животных клетках.

2. Измерение удельного веса клетки осуществляется путем подбора жидкости, не оказывающей токсического действия и с удельным весом, равным таковому клетки. Для этой цели пригодны, например, растворы гуммиарабика различной концентрации. Клетки помещаются в такую жидкость и центрифугируются. Удельный вес клеток и жидкости совпадает тогда, когда клетки не перемещаются при центрифугировании в этой жидкости. Таким же способом измеряется удельный вес изолированных ядер и органоидов клетки.

3. Определение показателя преломления клеток производится путем погружения клеток в индифферентные жидкости, обладающие разными показателями преломления. Когда показатели преломления клеток и среды совпадают, контуры клетки становятся невидимыми при наблюдении в фазово-контрастный микроскоп. Второй метод измерения показателя преломления основан на наблюдении клеток в интерференционном микроскопе. При этом по специальным формулам вычисляется отставание по фазе световой волны, прошедшей через клетку, по сравнению со световой волной, прошедшей вне клетки.

4. Определение внутриклеточного рН можно произвести путем прижизненного окрашивания клеток красителями, обладающими свойствами индикаторов (нейтральный красный, бромкрезиловый синий). В крупных клетках, например в гигантском нервном волокне, мышечном волокне, в крупных растительных клетках, рН определяется электрометрическим методом с применением микроэлектродов.

К этой же группе методов относится измерение электрического заряда поверхности клетки, измерение поверхностного натяжения и изоэлектрической точки клеток и др. Важно, чтобы определение всех перечисленных физико-химических свойств проводилось на живых, неповрежденных клетках.

<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Методы микрургии (микрохирургия) | Лекция 15. Химические, количественные методы в цитологии. Рентгеноструктурный анализ
Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2014-01-06; Просмотров: 5838; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.016 сек.