Метод рентгеноструктурного анализа

Методы микрохимического и ультрамикрохимического изучения клетки.

К микрохимическим относятся те методы, с помощью которых производится определение от 10 до 0,01 мг вещества. Эти методы широко используются в цитологии для определения содержания в клетках белков, фосфора, аминокислот, нуклеиновых кислот, сахаров и т. д. По характеру своему, по аппаратуре, которая используется для определения веществ, микрохимические методы не отличаются от обычных биохимических методов.

Но для целого ряда цитологических исследований совершенно необходимо определение очень малых количеств веществ в отдельных клетках или в отдельных частях клетки. В таких случаях применяются ультрамикрохимические методы, позволяющие проводить определение химических веществ в очень маленьком количестве материала, например в кусочках ткани, весящих 100-500 мкг, или в очень малых объемах растворов. Применение ультрахимических методов связано с использованием специальной аппаратуры, например: весов для взвешивания исключительно малых количеств вещества, капиллярных пипеток, ультрамик-робюреток и т. д. С помощью ультрамикрохимических методов можно определить содержание в клетке веществ порядка 10-10 - Ю-12 г.

Метод рентгеноструктурного анализа основан на явлении дифракции рентгеновских лучей. Он применяется для изучения строения молекул белков, нуклеиновых кислот и других веществ, входящих в состав цитоплазмы и ядра клеток. Метод дает возможность определить пространственное расположение молекул, точно измерить расстояние между ними и изучить внутримолекулярную структуру.

Методы исследования фиксированных клеток. В решении многочисленных цитологических проблем исследование живых клеток имеет исключительно важное значение, но, к сожалению, те методы прижизненного изучения, которыми сейчас располагает цитология, не могут еще дать исчерпывающей картины строения клеток и тканей. Поэтому до сих пор фиксированные препараты чрезвычайно широко используются в цитологии.

Следует признать, что структура клетки выявляется особенно отчетливо только на фиксированных препаратах, и исследования по морфологии, цитохимии и авторадиографии клеток с помощью как светового, так и электронного микроскопа проводить без таких препаратов пока невозможно.

Фиксация. Фиксация представляет собой начальный и чрезвычайно важный этап в изготовлении любого фиксированного препарата. Фиксаторы, быстро проникая в клетку, должны убить ее, не вызывая грубых изменений в клеточных структурах. Фиксаторы по возможности должны переводить все вещества, входящие в состав клетки, в нерастворимую форму, что очень важно для последующей обработки препарата (промывка в воде, проводка через спирты и т. д.).

Однако фиксация и последующая обработка вызывают в клетках и тканях целый ряд нежелательных изменений. Чаще всего наблюдается сморщивание и уменьшение объема, но иногда может происходить и набухание, сопровождающееся некоторым увеличением объема клеток. Нередко под влиянием фиксатора в цитоплазме и ядре образуются мелкие и крупные вакуоли, иногда фиксаторы вызывают появление новых, необычных структур, которые отсутствуют в живой клетке. Такие изменения носят название атерфактов, и к ним необходимо относиться критически, сравнивая фиксированные препараты с живыми объектами.

Чтобы по возможности избежать появления различных артефактов, для фиксации необходимо выбирать такую фиксирующую жидкость, которая подходит к данному объекту и дает возможность выявить структуры и вещества, подвергающиеся исследованию, нужно также правильно выбирать время фиксации, температуру фиксатора и другие условия. Фиксация любого объекта должна проходить быстро, чтобы в нем не успели произойти изменения, обычно наступающие сразу же после смерти клеток. Поэтому размер кусочков тканей и органов, предназначенных для фиксации, должен быть небольшим и, как правило, не превышать 5 мм.

Фиксаторы. Для цитологических исследований применяется множество разнообразных фиксирующих смесей, выбор которых в каждом отдельном случае зависит от целей и задач работы. Рассмотрим некоторые наиболее часто применяемые жидкости, обеспечивающие относительно хорошую фиксацию кусочков тканей и отдельных клеток.

Формалин. Формалин обычно употребляется в виде 4-10-процентного раствора. Формалин всегда содержит небольшую примесь муравьиной кислоты, которая вызывает образование осадков в клетках и нарушает тонкую структуру цитоплазмы и ядра. Поэтому для цитологических и тонких гистологических исследований лучше применять нейтральный формалин, полученный путем настаивания обычного формалина на СаС03. Нейтральный формалин хорошо сохраняет структуру клеток, вступая и соединение с белками, и пригоден как для изучения морфологии разнообразных клеток, так и для цитохимических реакций по выявлению белковых компонентов и особенно ферментов, полисахаридов и липидов, превращающихся после фиксации в нерастворимую форму. Время фиксации в формалине зависит от величины объекта: отдельные клетки можно фиксировать в течение 1 или нескольких часов, а небольшие кусочки тканей необходимо фиксировать 24 ч.

Этиловый спирт. Фиксация отдельных клеток, кусочков тканей и органов осуществляется 70-, 96- и 100-градусным (абсолютным) спиртом. Механизм действия спирта заключается в том, что он отнимает воду и вызывает необратимую денатурацию клеточных белков. Чистый спирт употребляется для фиксации, например, в тех случаях, когда нужно выявить полисахариды, легко растворяющиеся в воде. Полисахариды осаждаются спиртом, и последующая обработка препаратов должна производиться без воды. Этиловый спирт входит в состав ряда фиксирующих смесей, из которых наиболее часто применяется смесь Карнуа (1 мл уксусной кислоты, 6 мл 100-градусного этилового спирта и 3 мл хлороформа). Эта смесь удовлетворительно сохраняет структуры клетки и может быть использована для морфологических целей, хорошо сохраняет нуклеиновые кислоты, полисахариды, и фиксация ею пригодна для проведения цитохимических реакций. Время фиксации -- не больше 1-2 ч.

Фиксаторы, содержащие сулему. Обычно употребляется насыщенный водный раствор сулемы, который входит основной составной частью в целый ряд распространенных фиксирующих смесей, хорошо сохраняющих клеточные структуры. К числу таких смесей относятся: сулема с ледяной уксусной кислотой (100:5-6), смеси Ценкера, Гелли, Жильсона, Петрункевича, Максимова, Шаудинна и др. Растворы сулемы оказывают сильное осаждающее действие на белковые компоненты клетки и образуют осадки, нерастворимые в воде. При этом хорошо сохраняются ядерные и цитоплазматические структуры. Сулемовые фиксаторы применяются в основном для изучения морфологических особенностей разнообразных клеток. Но они также пригодны для цитохимического выявления белков и нуклеиновых кислот. Длительность фиксации объектов достигает 24 ч.

Фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту. Пикриновая кислота употребляется в виде насыщенного водного раствора. Она входит в состав смеси Буэна (пикриновой кислоты -- 15 мл, формалина -- 5 мл, уксусной кислоты -- 1 мл) и различных ее модификаций. Пикриновая кислота в ткани проникает медленно, и фиксация длится не менее 2 ч. Фиксирующие смеси с пикриновой кислотой прекрасно сохраняют все основные структуры и компоненты клетки и применяются в основном для морфологических целей. Кроме того, пикриновая кислота переводит в нерастворимое в воде состояние полисахариды (гликоген), и после фиксации возможна постановка цитохимических реакций для определения как полисахаридов, так и белков, которые также хорошо сохраняются.

Уксусная кислота. Уксусная кислота в чистом виде в качестве фиксатора не применяется, но входит в состав ряда фиксирующих смесей, часть которых была упомянута выше. При фиксировании клеток смесями, содержащими уксусную кислоту, хорошо сохраняются ядра, а также форма хромосом в делящихся клетках, осаждаются нуклеиновые кислоты, что позволяет применить цитохимические реакции для их определения.

Фиксаторы, содержащие осмий. Фиксирующие смеси, в состав которых входит четырехокись осмия («осмиевая кислота»), дают наилучшие результаты при фиксировании клеток, так как вызывают весьма незначительные артефакты. Поэтому все осмиевые фиксаторы широко используются для изучения морфологии клеток. Кроме того, осмий прекрасно фиксирует липиды, и они при его действии чернеют (липиды обладают способностью восстанавливать осмий до низшей окиси, окрашенной в темный цвет). Из наиболее часто употребляемых осмиевых фиксаторов следует назвать смеси: Флемминга (15 мл 2-процентной осмиевой кислоты, 1 мл ледяной уксусной кислоты), Шампи, Бенда, Альтмана и др., в которых содержатся те же компоненты, что и в смеси Флемминга, но в других соотношениях. Осмий довольно медленно проникает в ткани, и потому длительность фиксации зависит от величины объекта: отдельные клетки фиксируются около 20 мин - 1 ч, кусочки тканей - до 24 ч.

Одноклеточные организмы и изолированные клетки многоклеточных можно фиксировать парами осмиевой кислоты.

Благодаря прекрасным фиксирующим качествам четырехокись осмия применяется в качестве фиксатора в электронной микроскопии. Для электронно-микроскопического изучения объекты фиксируются 1-2-процентной осмиевой кислотой в течение 20 мин -- 1 ч и после фиксации подвергаются довольно сложной обработке.

Однако применение осмиевых фиксаторов, так же как и всех остальных, названных выше, содержащих ядовитые химические вещества, дает хорошие результаты при изучении морфологии клеточных структур и выявлении химических компонентов клетки с помощью цитохимических реакций. Все эти фиксаторы, за исключением формалина, почти полностью подавляют активность ферментов, содержащихся в ядре и цитоплазме. Формалин оказывается наиболее пригодным для выявления локализации и активности ферментов, хотя и он несколько подавляет активность большинства ферментов.

Фиксация путем замораживания и замораживания-высушивания (лиофилизация). Чтобы избежать воздействия химических реактивов и в процессе фиксации сохранить в неповрежденной форме прижизненные структуры клеток, выявить в них ферментативную активность, и был предложен метод лиофилизации. Сущность этого метода заключается и том, что кусочки тканей и органов, а также отдельные клетки быстро замораживаются при температуре жидкого азота (-196°С), а затем высушиваются в вакууме в условиях отрицательной температуры (от 40 до 65°С). После высушивания объекты переносятся непосредственно в расплавленный парафин и из них изготовляются срезы.

В ряде случаев применяется не лиофилизация, а просто замораживание объектов при температуре жидкого азота или даже при температуре сухого льда -- углекислоты (-78°С) с целью последующего выявления ферментов.

Приготовление постоянных препаратов. Постоянные препараты -- это мазки, тотальные препараты и срезы. Мазки используются при изучении клеток крови, бактерий, простейших, изолированных тканевых клеток. Мазки наносятся на предметное или покровное стекло, фиксируются одним из указанных выше фиксаторов, затем, если нужно, промываются в воде и окрашиваются.

Тотальные препараты изготовляют из таких мелких объектов, как простейшие, органы маленького размера, кусочки тканей (например, пленки эпителия) и т. д. При изготовлении тотального препарата объект фиксируется одним из названных фиксаторов, промывается в воде, переносится на несколько минут в 70-градусный спирт, а затем окрашивается. Окрашенный препарат обезвоживается в этиловом спирте, проводится через просветляющую жидкость и заключается в канадский бальзам.

Процесс изготовления срезов более сложен, чем приготовление мазков и тотальных препаратов. Для целей получения срезов, так же как и для получения тотальных препаратов, сразу же после фиксации необходима тщательная промывка в воде, цель которой -- удаление фиксатора из объекта. Промывку в воде нельзя делать только в том случае, если вещество, которое нужно определить, легко в ней растворяется. Например, нельзя промывать в воде объекты, зафиксированные 96- и 100-градусным спиртом, а также смесью Карнуа, в которых нужно определить гликоген, так как эти фиксаторы не переводят гликоген в нерастворимую форму. Особенно длительная и тщательная промывка в воде требуется после фиксации формалином, сулемовыми смесями, а также смесями с пикриновой кислотой и осмием. Процесс промывки в проточной или многократно сменяемой воде длится в этих случаях до 24 ч.

Промытые в воде объекты переносятся дальше в растворы этилового спирта возрастающей крепости (от 40 до 100 градусов). Цель такой проводки через этиловый спирт - обезвоживание и уплотнение объекта. После обезвоживания следуют среды, которые просветляют объект, т. е. ксилол, бензол, хлороформ, разнообразные масла.

При изготовлении тотальных препаратов объекты из ксилола переносятся в канадский бальзам, но можно также заключить их в глицерин или глицерин-желатину. При изготовлении срезов объект из ксилола или другой просветляющей среды заключается в такое пластическое вещество, которое способно пропитать клетки и все их структуры так, чтобы придать им консистенцию, позволяющую делать тонкие срезы. К числу таких пластических веществ относятся парафин, целлоидин и желатина. Для цитологических целей наиболее часто употребляется парафин, так как он дает возможность получить наиболее тонкие срезы. Заливка объектов в парафин производится в термостате при температуре 56-60° С, а заливка в целлоидин - при комнатной температуре.

Залитые в парафин объекты пригодны для изготовления тонких срезов, толщина которых обычно не превышает 5-10 мк. Срезы изготовляются на специальном приборе -- микротоме, который снабжен очень острой бритвой. Дальше из готовых срезов удаляется парафин путем проводки их через этиловый спирт уменьшающейся крепости (100°, 96°, 70°), затем они промываются в воде и окрашиваются. Окрашенные срезы вновь промываются в воде (если это нужно), проводятся через этиловый спирт, ксилол и заключаются в канадский бальзам или его заменители.

Канадский бальзам - это особый вид смолы, хорошо растворяющейся в ксилоле, бензоле и толуоле. Он применяется для заключения тотальных препаратов и срезов потому, что эти препараты сохраняются в нем в течение нескольких лет без особых изменений. Канадский бальзам хорошо просветляет срезы, быстро высыхает, тонкий слой его совершенно прозрачен, и его показатель преломления близок к показателю преломления воздуха.

В целом ряде случаев, например для изучения включений липидов в разнообразных клетках, для многих гистохимических исследований, применяется изготовление срезов на замораживающем микротоме. Замороженные срезы можно приготовить из нефиксированных кусочков тканей, а также после фиксации формалином и другими фиксаторами.

Таковы основные принципы изготовления постоянных препаратов клеток и тканей для изучения их с помощью светового микроскопа. Электронно-микроскопические исследования связаны с применением специальных методов обработки фиксированных объектов и изготовления срезов. Материал, зафиксированный четырехокисью осмия, после промывки обезвоживается в растворе этилового спирта возрастающей крепости (30, 40 и т. д. до 100С). Обезвоженные объекты заключаются в специальную среду, позволяющую делать ультратонкие срезы, толщина которых раина 100-500А. Средой для заливки очень мелких кусочков ткани (не больше 1-2 мм) или изолированных клеток служит пластическая масса: метакрилат, аралдит, среды типа желатины, эпоксидных смол и поливиниловых эфиров (ни парафин, ни другие среды, применяемые при изготовлении препаратов для световой микроскопии, для этой цели не подходят). Ультратонкие срезы получают на специальном приборе - ультрамикротоме.

Существует большое количество моделей ультрамикротомов, среди которых хорошими качествами характеризуется наша отечественная модель УМТ-2. Недостаток ультратонких срезов - это их малая контрастность. Для увеличения контраста изображения применяется обработка срезов специальными веществами, например уранилацетатом.

Окрашивание. Окрашивание постоянных препаратов -- необходимое условие для их последующего микроскопического изучения. Именно окрашивание позволяет различать разнообразные структуры клеток и тканей с такой четкостью, с какой они не могут быть выявлены никаким другим методом.

Красители, употребляющиеся для окраски препаратов клеток и тканей, относятся к веществам, которые по своим химическим свойствам разделяются на две группы: основные и кислотные. К первой группе принадлежат соли красящих оснований, чаще всего хлоргидраты, содержащие в своем составе аминогруппу. От аминогруппы и зависят их основные свойства. Основными красителями окрашиваются структуры клеток, обладающие кислотными свойствами. Эти структуры носят название базофильных.

Кислотные красители -- это свободные окрашенные кислоты или же их соли. Кислотные свойства красителей данной группы зависят от присутствия в них гидроксилов, а также групп SO2OH или СООН. Структуры клетки с основными свойствами окрашиваются кислотными красителями и носят название ацидофильных или оксифильных.

Существует также ряд нейтральных красителей, представляющих по своим химическим свойствам солеобразные соединения кислых и основных красителей. В таких солях и анион, и катион - радикалы, имеющие хромофорную группу, и при окрашивании клеток базофильные структуры окрашиваются компонентом красителя с основными свойствами, а ацидофильные структуры -- кислотным компонентом.

Наконец, для окраски липоидов и особенно нейтрального жира, содержащегося во многих клетках, пользуются индифферентными красителями (например, судам красный). Окраска ими основана на чисто физическом явлении, которое заключается в очень хорошей растворимости этих красителей в жирах, и они применяются для целей окраски нейтрального жира, содержащегося в цитоплазме клеток.

Окраска мазков, тотальных препаратов и срезов производится как натуральными (гематоксилин, кармин и др.), так и синтетическими красителями (метиленовая зелень, фуксин и др.). Из большого количества разнообразных видов красителей, применяющихся в цитологии, мы рассмотрим лишь немногие, и именно те, которые наиболее часто используются для общих и специальных методов окрашивания.

Общие методы окраски. Эти методы применяются главным образом при изучении морфологии клетки. Из красителей, хорошо окрашивающих ядра и цитоплазматические структуры, особенно на тотальных препаратах, можно рекомендовать квасцовый кармин, уксуснокислый кармин, борный кармин. Широко используется также окраска мазков, тотальных препаратов и срезов гематоксилином. Гематоксилин не относится к числу красителей, но он легко окисляется, превращаясь при этом в гематеин -- сильно красящее вещество. Поэтому все способы приготовления растворов гематоксилина для окрашивания препаратов предусматривают превращение гематоксилина в гематеин. Однако оба эти соединения не способны окрашивать клетки и их структуры без протрав, т. е. солей аммония, железа, меди и др., с которыми они образуют лаки - соединения типа солей.

Для окраски препаратов существует целый ряд рецептов приготовления гематоксилина: железный гематоксилин Гейден-гайна, Ясвоина, Вейгерта, квасцовый гематоксилин Бемера, Мейера, Эрлиха, Делафильда, фосфорно-вольфрамовый гематоксилин по Маллори и др. При окраске срезов железный гематоксилин часто комбинируется с различными кислыми красителями, например с эозином, придающим розовый цвет цитоплазме, с оранжевым Ж, светлым зеленым и др.

Из красителей, обладающих основными свойствами, часто употребляются метиловый зеленый, сафранин, метиленовый синий, тионин, толуидиновый синий, фуксин основной. Они дают особенно четкую окраску элементов клеточных ядер.

Широко распространены также сложные многокрасочные методы окрашивания срезов, мазков и тотальных препаратов клеток. Упомянутые выше комбинации гематоксилина с кислыми красителями -- один из простых примеров окраски такого типа, когда достигается большой контраст окраски ядерных и цитоплазматических структур.

К многокрасочным методам относятся также: трехцветный метод Маллори, применяемый для дифференциальной окраски различных тканевых элементов; окраска срезов эозин-азуром; окраска мазков и особенно мазков крови по Романовскому - Гимза. Метиловый синий - эозин по Манну дает очень четкую окраску ядерных структур. Метиловый зеленый - пиронин по Унна - чрезвычайно важная окраска для выявления ядерных и цитоплазматических структур, в которых дифференциально окрашиваются нуклеиновые кислоты: ДНК - в зелёный (метиловый зеленый) и РНК - в розовый цвет (пиронин).

Способы окраски препаратов обязательно должны сочетаться со способом фиксации объекта; каждый вид и качество окраски препарата теснейшим образом связаны с выбором того или иного фиксатора. Например, фиксация препаратов смесями, содержащими четырехокись осмия, не годится для последующего применения окраски эозин-азуром и трехцветным методом Маллори, окраска же гематоксилином возможна после различных способов фиксации, а для окраски метиловым зеленым - пиронином наилучшими фиксаторами служат смеси Карнуа, Гелли, Буэна.

Некоторые красители окрашивают структуры клеток и тканей в иной цвет, чем цвет самого красителя. Так, толуидиновый синий может давать синевато-красное, а синий тионин -- фиолетово-красное окрашивание. Такое явление носит название метахромазии и играет большую роль для выявления в клетках мукополисахаридов, хондриотин-серной кислоты в хряще и ряда других веществ, окрашивающихся метахроматически.

Наряду с разнообразными окрасками в цитологии довольно широко используются методы импрегнации клеточных структур металлами: серебром, золотом, осмием. Особенно часто импрегнируются серебром клетки нервной системы, соединительной ткани, клетки простейших.

Дата добавления: 2014-01-06