Цитохимические или гистохимические методы

Совершенно четкой и определенной границы между общими методами окрашивания и цитохимическими реакциями провести нельзя. Однако если задачу большинства общих методов окрашивания составляет выявление разнообразных клеточных структур и они неспецифичны для каких-либо определенных химических веществ, то цель цитохимических реакций заключается в определении именно химических веществ и их локализации в клетке. Поэтому для цитохимических реакций пригодны лишь те методы фиксации, которые позволяют фиксировать и осаждать химические вещества в тех местах, где они располагаются в живых клетках. После фиксации химические вещества должны быть в таком состоянии, чтобы они не растворялись при дальнейшей обработке, не выходили бы из клетки и не меняли бы своего положения в пределах клетки.

Для цитохимических исследований пригодны препараты клеток, фиксированных всеми указанными выше фиксаторами, причем каждый раз фиксатор выбирается в соответствии с тем, какое вещество должно быть выявлено. Пригодны также срезы свежезамороженных тканей, мазки, пленки эпителия, а также материал, подвергнутый лиофилизации.

С помощью цитохимических реакций можно прежде всего выявить все основные неорганические компоненты клетки: К, Na, Fe, Са, Си, Р, Hg, S, N и др. Выявление неорганических компонентов осуществляется широко известными из неорганической химии, но несколько видоизмененными в применении к биологическим объектам реакциями.

Белки. Белковые компоненты клеток можно определить, применяя многочисленные методы, большинство которых основано на определении отдельных аминокислот и реактивных групп, входящих в состав белковой молекулы. К числу таких методов относятся: ксантопротеиновая реакция, указывающая на присутствие в белке тирозина, феннлаланина, триптофана; реакция Мил-лона на присутствие тирозина; реакция Серра на аргинин; реакция тетразоииевого сочетания на тирозин, триптофан и гистидин и реакции на выявление сульфгидрильных (-SH), дисульфидных (S-S), аминогрупп (NH2) и других реактивных групп белковых молекул. Окрашивание белков кислотными и основными красителями при разных значениях рН позволяет определить кислые и основные белки (например, гистоны).

Нуклеиновые кислоты. Цитохимические методы по выявлению нуклеиновых кислот основаны на реакциях трех основных компонентов; фосфорной кислоты, углеводов и оснований. Один из методов окраски, который вместе с тем представляет и пример цитохимической реакции, уже был упомянут выше,-- это окраска метиловым зеленым -- пиронином по Браше. Основу этой реакции составляет способность метилового зеленого и пиронина давать солеобразные соединения с фосфорной кислотой, входящей в состав молекул нуклеиновых кислот. К такому же типу реакций относится окраска нуклеиновых кислот галлоцианином, который окрашивает и ДИК и РНК в серовато-синий цвет. Обе реакции не обладают достаточной степенью специфичности и требуют обязательного применения контроля, т. е. обработки препаратов ферментами; дезоксирибонуклеазой и рибонуклеазой. После действия первого фермента на препаратах не выявляется ДНК, а рибонуклеаза удаляет из клеток РНК, которая после обработки также не выявляется на контрольных препаратах.

Один из высокоспецифичных методов определения ДНК на мазках, тотальных препаратах и срезах представляет нуклеальная реакция Фельгена. Эта реакция включает два этапа: 1) гидролиз в 1 /V растворе HCI, цель которого -- превращение дезоксирибозы -- составной части молекулы ДНК в альдегид и 2) окрашивание в реактиве Шиффа (фуксин-сернистая кислота), обладающем высокой степенью чувствительности к альдегидам. Соединяясь с бесцветной фуксин-сернистой кислотой, альдегиды переводят ее в соединение, окрашенное в яркий красно-фиолетовый цвет.

Углеводы. Из углеводов, содержащихся в растительных и животных клетках, с помощью цитохимических методов можно выявить как моносахариды, например глюкозу, так и разнообразные полисахариды.

Цитохимический анализ полисахаридов основан на окислении их следующими окислителями: йодной кислотой, периодатом калия и натрия, хромовой кислотой.

Цель окисления - получение высокомолекулярных альдегидных соединений, которые затем выявляются реактивом Шиффа, подобно тому как это было только что указано для реакции Фельгена. Сама же реакция на полисахариды носит название реакции ШИК (Шифф-йодная кислота). Реактив Шиффа окрашивает разнообразные полисахариды, например гликоген, в яркий красно-фиолетовый цвет. Одновременно с гликогеном реактив Шиффа окрашивает в такой же яркий цвет другие полисахариды, и особенно кислые, типа мукополисахаридов, мукопротеидов и др. Для раздельного определения этих веществ используется приготовление контрольных препаратов, на которых гликоген удаляется из клеток обработкой птиалином слюны. Вещества же типа мукополисахаридов, мукопротеидов и кислые полисахариды типа гиалуроновой кислоты требуют применения специальных методов определения. Одна из реакций на такие соединения уже была названа выше: это явление метахромазии.

Гликоген на мазках, тотальных препаратах и срезах можно определить также путем окрашивания йодом или раствором Люголя (йод - 1 г, К! - 2 г, дистиллированная вода - 300 мл). Под действием йода гликоген окрашивается в красно-бурый или коричневый цвет.

Липоиды. Нейтральный жир, находящийся в, цитоплазме клеток, избирательно окрашивается красным Суданом III в оранжево-красный цвет и черным Суданом -- в черный цвет. Судан черный окрашивает и другие структуры "клеток, в которых содержатся липоиды. Имеется также ряд методов для определения в клетке веществ, содержащих в своем составе липоиды, например холестерин.

Ферменты. В настоящее время методы цитохимии позволяют выявить около 50 различных ферментов, находящихся в клетках и тканях. Если при цитохимическом определении белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов выявляются какие-то структурные части их молекул, то при определении ферментов выявляется их активность.

Для того чтобы обнаружить активность какого-либо фермента, клетки помещаются в среду, содержащую субстрат для данного фермента. Фермент расщепляет субстрат, а последний выбирается с таким расчетом, чтобы один из продуктов расщепления можно было выявить при помощи цветной реакции. Очень важно, чтобы субстрат, участвующий в реакции, был хорошо растворим и легко проникал бы в клетку. Напротив, окрашенные конечные или промежуточные продукты реакции, не должны быть растворимыми и должны располагаться именно в тех частях клетки, где они находятся в прижизненном состоянии, а не диффундировать в соседние клетки или в другие части одной и той же клетки.

Примером реакций определения ферментативной активности в клетках может служить реакция на сукцинатдегидрогеназу - важнейший фермент, участвующий в окислительно-восстановительных процессах.

Основу этой реакции составляет восстановление с помощью этого фермента бесцветной и хорошо растворимой соли тетразолия (биосубстрат) в почти нерастворимый формазан (конечный продукт реакции), окрашенный в синий или сине-фиолетовый цвет.

При цитохимическом определении активности гидролитических ферментов (фосфатазы, липазы и др.) в растворимые субстраты, которыми могут служить альфа и бетта-глицерофосфат, адено-зинтрифосфат и некоторые другие органические соединения, содержащие фосфор, добавляются ионы металлов.

В процессе расщепления таких субстратов ферментами окрашенные продукты реакции осаждаются в местах ферментативной активности в виде малорастворимых солей кальция, свинца, меди, кобальта и других металлов.

Дата добавления: 2014-01-06