Лекція 1. Вступна лекція

Предмет вивчення дисципліни „Цитологія, гістологія, ембріологія” та її місце в системі біологічних і ветеринарних дисциплін. Значення цієї дисципліни для підготовки лікаря ветеринарної медицини. Історія розвитку цитології, гістології і ембріології. Гістологічні методи досліджень.

Дисципліна “Цитологія, гістологія, ембріологія ” складається із чотирьох розділів: “Цитології”, “Загальної гістології”, “Спеціальної гістології” і “Ембріології”. Кожний із розділів має свій предмет вивчення. Цитологія вивчає клітини, загальна гістологія – тканини, спеціальна гістологія – мікроскопічну- будову органів. Тісно пов`язана з попередніми розділами і ембріологія – наука про зародок. Це зумовлено тим, що структури організму (клітини, тканини, органи) вивчаються у процесі їх виникнення та розвитку. Таким чином предметом вивчення цитології, гістології та ембріології є мікро- і субмікроскопічна будова структурних складників організму, та їх становлення в процесі ембріонального розвитку.

Цитологія, гістологія, ембріологія – це біологічна дисципліна. Вона тісно пов’язана майже з всіма біологічними дисциплінами і насамперед з анатомією, фізіологією і біохімією. Як відомо, анатомія вивчає форму органів, їх топографію та зовнішню і внутрішню будову, структури якої видимі неозброєним оком. Cпеціальна ж гістологія вивчає мікроскопічну будову органів. При цьому виявляються структури органів, які не можна побачити неозброєним оком. Дані про ці структури суттєво доповнюють і поглиблюють знання про будову окремих органів та цілісного організму. Фізіологія – це наука про життєдіяльність організму, яка зумовлена функціями окремих органів, їх системами і апаратами. Функцію або функції органа забезпечують його структурно-функціональні одиниці, які можна побачити тільки за допомогою мікроскопа. Структурно-функціональні одиниці органів розглядають при вивченні загальної і спеціальної гістології. В основі життєдіяльності організму знаходиться обмін речовин, який має окремі етапи у тому числі і внутрішньотканинний. Внутрішньотканинний обмін речовин – це низка біохімічних реакцій, що відбуваються у структурах клітин і міжклітинної речовини, які є об`єктом вивчення біохімії. Особливості ж будови цих структур розкривають цитологія і загальна гістологія. У зв`язку з цим цитологія, гістологія, ембріологія, анатомія, фізіологія і біохімія є фундаментальними дисциплінами у підготовці лікаря ветеринарної медицини. Їх знання формують у студентів базу про будову організму тварин на різних рівнях його структурної організації, дають можливість зрозуміти їм механізми життєдіяльності організму в нормі.

Дисципліна „Цитологія, гістологія, ембріологія” має тісний зв`язок із дисциплінами, які безпосередньо формують лікаря ветеринарної медицини. Її знання необхідні для розуміння та успішного засвоєння патологічної анатомії, окремих розділів клінічної діагностики, хірургії, біотехнології, імунології, акушерства, гінекології, штучного осіменіння, офтальмології, радіобіології, вірусології, токсикології, паразитології, ветеринарної генетики, тощо.

Історія розвитку цитології, гістології та ембріології. Становлення кожної науки і, відповідно дисципліни, залежить від розвитку її методів досліджень. Це в повній мірі стосується і гістології, цитології та ембріології. Для проведення цитологічних, гістологічних і ембріологічних досліджень необхідні мікроскопи. У зв`язку з цим успіхи становлення дисципліни залежали і залежать від розвитку оптики, конструювання мікроскопів і техніки мікроскопіїї.

В історії розвитку цитології, гістології та ембріології можна виділити три періоди: домікроскопічний, мікроскопічний і електронномікроскопічний. Домікроскопічний період простягався з сивої давнини до середини ХУІІ-го століття. В цей період мікроскопів не було і уявлення людей тих часів про тканини і органи базувались на їх фізичних властивостях. Вони ділили їх на рідкі, тверді, пухкі, червоні, білі, жовті, тонуть або не тонуть у воді тощо. За даними сучасної гістології, які базуються на світловій і електронній мікроскопії, такі уявлення були примітивними і не відображали будову тканин і органів. У цей же період, немікроскопічними дослідженнями Гіппократа (460 – 370 рр. до н.е.) і Арістотеля (384 – 322 рр. до н.е.) була започаткована ембріологія.

Мікроскопічний період починається з середини ХУІІ–го століття і триває до цього часу. В цей період, для вивчення рослинних і тваринних організмів, використовували і використовують світлові мікроскопи. Завдяки цим мікроскопам були започатковані власне гістологія, цитологія і спеціальна гістологія та мікроскопічна ембріологія.

Хто вперше і коли винайшов мікроскоп до цього часу точно не відомо. З цього приводу є багато версій, основними з яких є дві. Прихильники першої версії вважають, що вперше мікроскоп сконструювали у 1590 році голландські шліфувальники лінз для окулярів Ханс і Захарій Янсени. Але достовірних документальних підтверджень цього факту не має. Автори другої версії, більш правдоподібної, стверджують, що перший мікроскоп винайшов у 1609 – 1610 роках італійський вчений Г. Галілей, який до цього сконструював підзорну трубу. Є відомості, що Г.Галілей подарував мікроскоп вченим римської „Академії прозорливих” і, які за його допомогою розглядали частинки засушених рослин і комах. Як точно називали перші мікроскопи невідомо. Термін „мікроскоп” першим ввів у практику в 1625 році німецький вчений І. Фабер.

Перші мікроскопи були примітивними, але їх постійно вдосконалювали. Вони набули широкого поширення в країнах Європи де їх, в основному, місцева знать використовувала для розважальних цілей. Першим хто зрозумів і продемонстрував значення мікроскопа як інструмента наукових досліджень був англійський фізик Р. Гук, який також першим ввів у науку термін „клітина”. За допомогою удосконаленого ним мікроскопа він розглядав різні дрібні об`єкти і замальовував їх. Результати своїх спостережень він опублікував у 1665 році в монографії „Мікрографія або фізіологічний опис дрібних тіл, досліджених за допомогою мікроскопа”. Вони відкрили нову область вивчення будови об`єктів живої і неживої природи.

Після цього мікроскопи почали використовувати для вивчення рослинних і тваринних організмів. За їх допомогою було зроблено низку відкриттів, які в той час не одержали належної оцінки. Причинами цього були не висока якість мікроскопів і пануюча в той час у натурфілософії теорія преформації, яка стверджувала, що розвиток організму – це збільшення в розмірах його органів уже наявних у зародку. Незважаючи на те, що мікроскопи постійно удосконалювали їх недоліком була хроматична аберація, яка спотворювала зображення. Спроби запобігти її проводилися, але вони не мали успіху. Винайдення ахроматичного мікроскопа є пріоритетом вчених Петербургської академії наук. Його теоретичну основу розробив академік Л.Ейлер (1771), а сконструював – академік Ф.Епінус (1784). Завдяки цьому мікроскопу зображення об`єктів досліджень є чіткими. На їх поверхні світлові промені не розкладаються на всі кольори райдуги. Дослідники багатьох країн світу, використовуючи ахроматичні мікроскопи та їх модифікації для спеціальних досліджень, заклали основи сучасної цитології, гістології та мікроскопічної ембріології. Цьому сприяла також нова теорія розвитку – епігенезу, яку обгрунтував К.Ф.Вольф (1733 – 1794) і, яка доказала хибність теорії преформації. За цією теорією розвиток організму відбувається від простого до складного.

Особливо значний внесок у становлення цитології і гістології тварин зробив чешський вчений Я. Пуркіньє (1787 – 1869) та його учні. Він є одним з фундаторів мікроскопічної техніки. Його прізвищем назвали багато мікроструктур організму тварин, які він вперше описав.

Підгрунтям сучасної ембріології тварин стали наукові здобутки К.Ф. Вольфа, Г.Х.Пандера (1794 – 1865) і К.М.Бера (1792 – 1876), О.О.Ковалевського (1840 – 1901) та їх учнів.

Вагомий внесок у розвиток гістології і ембріології тварин зробили у ХУІІІ і ХІХ століттях наші вітчизняні вчені. Це П.Перемежко (1833 – 1894) – один із перших описав мітоз, О.Шумлянський (1748 – 1795) – вперше описав капсулу і петлю нефрона, М.Тереховський (1740 - 1796) – експериментально доказав неможливість самозародження. У ХХ столітті значну роль у становленні цитології, гістології і ембріології тварин мали наукові праці та підручники Є.Ф.Лисицького (1873 – 1955), П.О.Ковальського (1905 – 1983), Г.С.Крок (1910 – 1996), О.Г.Безносенка (1905 – 1976), О.І.Кононського, П.М.Мажуги та їх учнів.

Нову еру в цитологічних і гістологічних дослідженнях започаткувала електронна мікроскопія. Її ідею і конструкцію електронного мікроскопа розробили у 1928 – 1931 роках Е.Руска, М.Кнолль та Б.Боріє. За допомогою електронного мікроскопа можна одержати збільшення об`єктів досліджень у десятки і сотні тисяч разів. Завдяки цьому мікроскопу були відкриті нові структури клітин, суттєво поглиблені знання про будову вже відомих частин клітин та міжклітинної речовини.

Методи досліджень. Для цитологічних, гістологічних і ембріологічних досліджень використовують різноманітні методи досліджень. При цьому обов`язково приміняють спеціальний прилад – мікроскоп. У зв`язку з цим ці методи називають мікроскопічними.

Залежно від стану об`єкта досліджень методи поділяють на прижиттєві і посмертні.

Найбільш вживані прижиттєві методи – це метод культур тканин, метод прозорих камер і метод з використанням мікроскопів – ілюмінаторів. Метод культур тканин дає змогу спостерігати ріст і розмноження клітин. За допомогою методу прозорих камер, які вставляють у вушну раковину кроля прослідковується ріст кровоносних і лімфатичних судин. Метод з використанням мікроскопів-ілюмінаторів приміняється переважно в навчальній роботі. За його допомогою можна спостерігати рух крові в кровоносних судинах брижі кишечнику дрібних тварин.

Посмертні методи досліджень найбільш поширені. Вони дають змогу виготовити постійні гістологічні препарати, які використовують у навчальній та науковій роботі. На цих препаратах вивчають будову клітин, тканин і органів.

Процес виготовлення постійного гістологічного препарату включає в себе низку етапів: одержання матеріалу, його фіксація, промивання, обезводнення та ущільнення, виготовлення зрізів з ущільненого матеріалу, фарбування зрізів, обезводнення і просвітлення зафарбованих зрізів, заведення зафарбованих зрізів у бальзам.

Матеріал для виготовлення препаратів відбирають відразу після смерті тварин. Із органів, гострим лезом вирізують шматочки розміром 1х1х0,5 см, які етикують. На етикетці відмічають господарство (власника), якому належала тварина, вид тварини, орган, з якого були відібрані зразки і час відбору. Матеріал для виготовлення гістопрепаратів можна відбирати і від живих тварин шляхом біопсії.

Для збереження клітинної та тканинної будови відібраного матеріалу його необхідно піддати фіксації (консервації). Розрізняють фізичні і хімічні методи фіксації. Фізичні методи використовують рідко. Вони передбачають швидке заморожування відібраного матеріалу з подальшим його висушуванням у вакуумі. Хімічні методи найбільш поширені. При цьому для фіксації використовують хімічні фіксуючі речовини – фіксатори. До них пред`являються наступні вимоги. Вони повинні добре проникати у відібраний матеріал, швидко коагулювати або осаджувати білки і не здійснювати негативний вплив на подальшу обробку матеріалу. Для фіксації використовують скляний або глиняний посуд. Об`єм фіксуючої рідини повинен у 20 разів перевищувати об`єм матеріалу відібраного для фіксації. Мінімальний термін фіксації становить 24 години.

Фіксуючі речовини ділять на прості і складні. Найбільш поширеними простими фіксуючими рідинами є 5–15% водний розчин нейтрального формаліну, 96⁰ або абсолютний етиловий спирт, ацетон, 1–2% розчин осмієвої кислоти і насичений розчин пікринової кислоти.

Складні фіксуючі речовини включають декілька діючих речовин. Серед складних фіксуючих речовин найчастіше використовують рідину Карнуа (етиловий спирт, хлороформ, льодова оцтова кислота), рідину Орта (дистильована вода, формалін, біхромат калію, сульфат натрію) і суміш Буена (пікринова кислота, льодова оцтова кислота, формалін).

Вибір фіксуючої речовини залежить від мети та завдань досліджень, виду матеріалу, хімічних властивостей речовин і терміну виготовлення препаратів.

Після фіксації матеріал промивають. Мета промивання – це видалення із фіксованого матеріалу фіксуючих речовин. Залежно від виду фіксатора, промивання здійснюють проточною водопровідною водою або етиловим спиртом. Останнім промивають матеріал, який фіксувався речовинами, які містять пікринову кислоту і рідиною Карнуа. Термін промивання залежить від розмірів шматочків відібраного матеріалу. Він може бути від 24 до 48 годин.

Промитий матеріал зневоднюють (дегідратація). Мета зневоднення – видалити з матеріалу воду. Якщо матеріал фіксували етиловим спиртом його зневоднення не проводять. Зневоднення здійснюють спиртами зростаючої міцності (50⁰, 70⁰, 80⁰, 90⁰, 96⁰ і абсолютний спирт). У кожному із спиртів матеріал витримують від однієї до 12 год., що залежить від його розмірів.

Із зневодненого матеріалу не можна виготивити якісні зрізи, так як він не щільний і недостатньо пружний. Для виготовлення зрізів матеріал необхідно ущільнити – просочити ущільнюючими речовинами (залити). Для ущільнення найбільш часто використовують парафін і целоїдин. Як відомо, целоїдин і парафін розчиняються у спеціальних розчинниках (ксилол, толуол, хлороформ, ефір). У зв`язку з цим, для успішного проведення ущільнення матеріал необхідно попередньо просочити цими розчинниками. Вони ж і витісняють із матеріалу спирт. Ущільнення матеріалу проводять не чистими парафіном і целоїдином. Для цього готують суміші парафіну з ксилолом, або з хлороформом чи толуолом (1:1), а також розчини целоїдину в етиловому спирті та диетиловому ефірі.

Після ущільнення матеріал заливають у парафін або целоїдин і одержують блоки, які фіксують до дерев`яних брусочків. Брусочки, довжиною 2,5 см, шириною – 1,5 і товщиною 1,0 см бажано вирізати із твердих порід дерева.

Із виготовлених блоків роблять зрізи на спеціальному приладі, який називається мікротом. Є два основні типи мікротомів. На мікротомах першого типу готують зрізи із парафінових і целоїдинових блоків. Мікротоми другого типу – заморожувальні. На них готують зрізи із замороженого матеріалу.

До складу мікротомів обов`язково входять такі компоненти: станина, тримач ножа, механізм мікроподачі, тримач блока, мікротомний ніж і механізм, який забезпечує рух тримача ножа.

Виготовлені зрізи наносять на предметні стекла. Останні попередньо миють у мильному розчині, висушують і обезжирюють етиловим спиртом.

Наступним етапом виготовлення постійного препарату є фарбування зрізів. Завдяки цьому в препаратах диференціюються структури клітин і тканин, які мають здатність сприймати певні фарбники (зафарбовуватись у певний колір). Перед фарбуванням із зрізів необхідно видалити ущільнюючі речовини. Для цього використовують розчинники парафіну або целоїдину.

Фарбування проводять за спеціальними прописами і залежно від мети досліджень використовують різні барвники. Їх ділять за походженням на натуральні (гематоксилін, кармін) і синтетичні (еозин, фуксин). Натуральні барвники можуть бути рослинного (гематоксилін) і тваринного походження (кармін). За фарбуючою спроможністю певних структур сприймати барвники останні також ділять на основні (ядерні), кислі (цитоплазматичні), нейтральні та індиферентні. Основні барвники – це основи або їх солі (гематоксилін, кармін). Вони фарбують структури, які містять кислотні залишки. Здатність певних структур сприймати основні барвники називають базофілією. Кислі барвники за хімічною природою – це кислоти або їх солі (еозин, фуксин). Вони фарбують структури клітин і міжклітинної речовини, до складу яких входять основи. Структури, які фарбуються кислими барвниками називають ацидофільними (оксифільними). Нейтральні барвники представляють собою суміші, які містять основні і кислі барвники (фарба Романовського – Гімза). Індиферентні барвники здатні розчинятися тільки в певних речовинах, виявляючи їх (судани).

Існує багато методів фарбування препаратів за допомогою яких, виявляють певні структури клітин і тканин, що залежить від мети досліджень. Слід відмітити, що є і прижиттєві методи фарбування клітин.

Зафарбовані зрізи обезводнюють, затим просвітлюють у ксилолі та заводять у спеціальне середовище. Мета заведення зрізів у середовище – збереження препаратів у доступному для світлової мікроскопії вигляді. У якості середовища найчастіше використовують бальзам. При заведенні зрізи накривають накривним скельцем.

Крім гістологічних препаратів, для виготовлення яких використовують тонкі зрізи тканин і органів, є і інші види цих препаратів. До складу їх входять мазки (крові, секретів залоз тощо), відбитки (тимуса, лімфофузлів, печінки, слизових оболонок тощо) плівкові препарати (серозних оболонок, волокнистої сполучної тканини, м`якої мозкової оболонки) і тотальні препарати (зародки ранніх стадій розвитку).

Виготовлені препарати вивчають за допомогою світлового мікроскопа – світлова мікроскопія. Існує багато типів і моделей світлових мікроскопів, але всі вони мають єдиний план будови. До їх складу входять три частини: механічна, оптична і освітлювальна. Роздільна здатність світлового мікроскопа – це мінімальна відстань між двома точками на гістопрепараті, які можна розрізнити як окремі. За допомогою сучасних світлових мікроскопів можна розглядати структури більш ніж 0,2 мкм.

Крім описаного вище основного (класичного) методу досліджень у цитології та гістології використовують і багато інших спеціальних методів.

Гістохімічний метод дає можливість виявити у клітинах і міжклітинній речовині певні речовини (білки, ліпіди, вуглеводи, нуклеїнові кислоти тощо). Цей метод грунтується на здатності речовин клітин і міжклітинної речовини реагувати з хімічними реактивами і утворювати зафарбовані продукти реакції.

Авторадіографічним методом вивчають міграцію і локалізацію речовин та їх сполук, які були попередньо помічені радіоактивними ізотопами. У гістологічних зрізах ці речовини виявляють за допомогою фотоемульсії, якою накривають препарат, а затим її проявляють. Після проявлення, у місцях контакту фотоемульсії з радіоактивними речовинами, виявляються засвічені ділянки – треки.

Імуногістологічні методи використовують для ідентифікації окремих видів клітин та речовин синтезованих у них. Ці методи базуються на реакціях антиген – антитіло.

За допомогою цитоспектрофотометричного методу можна визначити кількісний вміст речовин у клітинах на основі вивчення спектрів поглинання ними світлових променів.

Для дослідження незафарбованих об`єктів використовують фазовоконтрастну, темнопольову і люмінісцентну мікроскопію.

Фазовоконтратна мікроскопія дає змогу виявити структури, які мають різні показники заломлення світла.

При темнопольовій мікроскоп ії приміняють темнопольовий конденсор. Завдяки цьому на темному тлі помітні сріблясті контури об`єктів.

За допомогою люмінісцентної мікроскопії виявляють живі структури на основі люмінісценції – здатності світитися при поглинанні променів короткохвильової частини спектра (первинна люмінісценція). Зазвичай вона слабка. Для її посилення використовують спеціальні барвники (вторинна люмінісценція).

Для дослідження реакцій живих клітин на вилучення або пошкодження її складових приміняють методи мікрургії клітин. При цьому, за допомогою спеціальних мікроманіпуляторів із них вилучають ядро, ядерце, окремі хромосоми тощо.

Крім світлової мікроскопії є ще й електронна мікроскопія. Її ділять на трансмісійну (просвічуючу) і сканувальну. За допомогою сканувального мікроскопа отримують об`ємне зображення об`єкта досліджень. Підготовка препаратів для електронної мікроскопії включає такі ж етапи як і для світлової мікроскопії, але вони мають значні особливості. За допомогою електронного мікроскопа можна розглянути структури клітин і міжклітинної речовини менші ніж 0,2 мкм.

Запитання для самоконтролю

1. Які розділи включає дисципліна „Цитологія, гістологія, ембріологія”? 2. Що вивчає цитологія, загальна гістологія, спеціальна гістологія і ембріологія? 3. З якими дисциплінами пов`язані цитологія, гістологія і ембріологія? 4. Які періоди виділяють у розвитку цитології, гістології та ембріології і чим вони характеризуються? 5. Хто і коли вперше сконструював світловий мікроскоп? 6. Назвіть методи досліджень, які використовують у цитології, гістології та ембріології. 7. Назвіть по порядку етапи виготовлення постійного гістологічного препарату. 8. Назвіть найбільш вживані фіксуючі речовини. 9. Які є критерії класифікації барвників? 10. Які частини входять до складу світлового мікроскопа?

Дата добавления: 2014-01-07