РНК – родоначальник биологической эволюции

Как и обещано, начнём с повторения центральной догмы молекулярной биологии. Итак, информация хранится в ДНК, а воплощается в белках, промежуточным звеном на этом пути выступает РНК. Коротко ее можно сформулировать так «ДНК-РНК-белок». Сначала по матрице ДНК (по участку, соответствующему данному гену) синтезируется мРНК. Этот процесс переписывания нуклеотидной последовательности с ДНК на РНК называется транскрипцией. Здесь меняется только физический носитель, язык остается тем же. Затем, по данным мРНК на рибосомах происходит синтез белка. Этот процесс перевода с языка нуклеотидной последовательности в последовательность аминокислот называется трансляцией.

В прошлый раз мы рассмотрели репликацию ДНК, сегодня мы переходим к самому потоку информации и начинаем с его первой стадии, транскрипции. Реализация генетическокй информации, хранящейся в ДНК, всегда начинается с образования молекулы РНК. На первый взгляд, отличие РНК от ДНК совсем незначительные, а именно гидроксил вместо водорода в положении 2’ и урацил вместо тимина. Однако эти незначительные различия заключают в себе колоссальный потенциал для выполнения разнообразных функций в клетке. РНК может быть не только носителем генетической информации, но и катализатором. Это единственная молекула, совмещающая в себе эти две способности. Отсюда и проистекают многочисленные спекуляции по поводу того, что РНК и стала родоначальником жизни на нашей планете.

Известно несколько классов РНК, обладающих своей определенной функцией.

1. Рибосомальные РНК (рРНК) – структурные компоненты рибосом, молекулярных машин для белкового синтеза.

2. Матричные РНК (мРНК) (Messenger RNA) – макромолекулы, несущие информацию об одном или нескольких генах, в них переписаны соответствующие последовательности, необходимые для синтеза отдельных (одного или нескольких) белков. Напомним, что геном называется фрагмент ДНК, необходимый для синтеза одного функционального биологического продукта – белка или последовательности РНК. мРНК служат для переноса информации к рибосомам.

3. Транспортные РНК (тРНК) (transfer RNA) это молекулы-адапторы, которые обеспечивают перевод из генетического кода на язык аминокислот в белках.

Какую бы РНК мы ни взяли, мРНК, или тРНК или рРНК, она всегда будет однонитиевой. Однако это не значит, что ее пространственная структура будет случайной. Стекинг-взаимодействие никто не отменял. Оно приводит к формированию правой спирали, похожей на половинку от спирали ДНК. Если в последовательности есть самокомплиментарные участки, там будут образовываться более сложные структуры. РНК может образовывать комплиментарные пары с цепью РНК (другой или своей же) или ДНК. Пары будут такие же, как в ДНК, G-C и A-U. Тут есть одно исключение-дополнение: может образовываться необычная для ДНК пара G-U. В отличие от ДНК у РНК нет четко определенной пространственной структуры, которую можно было бы предсказать. Трехмерная структура многих РНК, подобно белкам сложна и уникальна. Там, где присутствуют комплиментарные участки, получается двойная спираль, типа A. Шпильки – самые часто встречающиеся структуры. Там, где правило комплиментарности нарушается, образуются внутренние петли и выпячивания. Z-форму РНК получали в лаборатории в условиях очень высоких солей. В-форму получить так и не удалось.

В связи с процессом транскрипции нас будут интересовать мРНК. В высших организмах мРНК, как правило, кодирует одну полипептидную цепь и называется моноцистронной. В прокариотах мРНК может кодировать несколько полипептидов и называться полицистронной.

Синтез РНК по матрице ДНК (ДНК-зависимый синтез РНК) во многом похож на синтез ДНК, т.е. на процесс репликации ДНК. Его выполняет ДНК-зависимая РНК-полимераза. Ей требуется матрица ДНК, все четыре рибонуклеотида трифосфата и Mg. Сам фермент содержит цинк (Цинковые пальцы?) Химия синтеза РКН очень похожа на химию синтеза ДНК, так же происходит присоединение к NTP к 3’ концу существующей цепи, т.е. синтез идет в направлении от 5’ к 3’ концу. При синтезе используется только одна из двух цепей ДНК, которая читается, соответственно, от 3’ к 5’ концу. Каждый нуклеотид в новой РНК выбирается по принципу комплиментарности: U ставится напротив A, A – напротив Т.

Две цепи ДНК не равнозначны, в них записаны разные последовательности. Для обозначения той цепи, по которой происходит транскрипция, вводят понятие +-цепи и –цепи. Чтобы воспроизвести в РНК с точностью до замены U на T последовательность одной цепи ДНК, читаемую от 5’ к 3’, (назовём ее плюс-цепью, или кодирующей цепью) надо вести синтез, используя в качестве матрицы комплиментарную ей цепь. Называется она минус-цепью, или матрицей, читается она от 3’ к 5’.

Так же как и в ДНК, чтобы происходил синтез, цепи ДНК надо сначала разъединить. Должен образоваться транскрипционный пузырёк. Во время транскрипции РНК-полимераза поддерживает цепи разъединенными на протяжении 17 пар, разматывая цепи впереди. Тут всё, как в ДНК. Теперь начинаются различия. Если репликативная вилка движется в обе стороны, и глазок всё время увеличивается, то транскрипция идет только в одну сторону и величина пузырька не меняется. Если в ДНК вновь синтезированная цепь так и остается спаренной с матрицей, то РНК-ДНК гибрид существует временно, получается очень коротким, так как счищается вскоре после образования. Поэтому вслед за РНК-полимеразой цепи ДНК снова сцепляются, и РНК-полимераза их сматывает обратно. Всё это требует значительного вращения всей молекулы. Однако в клетке вращение обычно затруднено, и движение РНК-полимеразы приводит к образованию отрицательных сверхвитков позади комплекса и положительных – впереди. Такую суперспирализацию ДНК наблюдали и in vitro и (в бактериях) in vivo. Возникающие проблемы с топологией снимают топоизомеразы. Транскрипция в E.coli идет со скоростью 50 нуклеотидов в секунду.

РНК-полимеразе для начала синтеза не нужен праймер. Однако это не значит, что синтез может начаться с любого места. Синтез начинается с определенных последовательностей, называемых промоторами. Синтез начинается с пуринового основания (А или G), у которого не отщепляется 3-фосфат в положении 5’.

В отличие от ДНК-полимераз у РНК-полимеразы нет способности проверять свои ошибки, поэтому одна ошибка приходится на 10^-4 – 10^-5 оснований. Как можно это допустить? А это не так страшно, как в ДНК. В ДНК каждая клетка получает одну копию ДНК, которая дается ей на всю жизнь. С ДНК получается множество РНК-копий, которые, надо отметить, долго не живут. В результате неспецифического гидролиза они постепенно разрушаются, а на их место приходят новые. За время жизни клетки (от деления до деления) популяция РНК обновляется около 10 раз.

Откуда начинается синтез? С промотора, т.е. специфической последовательности ДНК, которую узнает и связывает РНК-полимераза. За правильное узнавание промотора и связывание отвечает сигма-субъединица. По договоренности, основанию, с которого начинается РНК присваивают номер +1, поэтому последовательности промоторов, находящиеся раньше, получают номера –10 и –35. Последовательности могут быть различны, но удалось выявить наиболее часто встречающиеся нуклеотиды, образующие консенсус-последовательности. Инициация транскрипции происходит в два этапа. Сначала РНК-полимераза связывается с ДНК и находит область – 35. Образуется «закрытый комплекс». Потом РНК-полимераза смещается в область –10, и разматывает цепи ДНК примерно на 17 пар, начиная от –10. При этом она еще сильнее связывается с размотанными нитями, образуя «открытый комплекс». Начинается синтез РНК с присоединения первого NTP. После присоединения нескольких оснований сигма-субъединица диссоциирует. Процесс разделения ветвей РНК-полимеразе облегчает уже существующая отрицательная суперспирализация ДНК. То, что РНК-полимераза действительно сидит на ДНК и занимает там какое-то конечное место, можно показать на опыте (foot-prints).

Инициация транскрипции регулируется. Клетка должна производить не всё подряд, что имеется у нее в геноме, а то, что нужно в данный момент, и в тех, пропорциях, в которых это требуется. Один из уровней контроля – различное сродство РНК-полимеразы к промоторам, определяемое различиями в их последовательностях. Есть целый набор белков, которые могут узнавать последовательности перед и после промотора, и либо способствовать, либо препятствовать связыванию РНК-полимерзы. Так как транскрипция – это первый этап, ведущий к синтезу белков, то значительная доля регуляции количества производимых белков, приходится именно на этот этап. Иногда могут использоваться разные сигма-факторы, что обеспечивает возможность выбирать, какие гены транслировать. У прокариот всего одна РНК-полимераза, в эукариот – 3, каждая со своей функцией. РНК-полимераза II делает мРНК, РНК-полимераза III делает тРНК и 5S-рРНК, РНК-полмераза I – 5.8 S, 28 S и 18S.

Терминация транскрипции. Синтез РНК продолжается до тех пор, пока полимераза не встретит последовательность, отвечающую за ее диссоциацию. Существует, по крайней мере, два типа таких последовательностей. Первый тип содержит «палиндром», приводящий к образованию шпильки с центром за 15-20 нуклеотидов до конца РНК, за которым следует последовательность поли(А), преобразуемая в поли(U). Считается, что образование шпильки приводит к разрушению РНК-ДНК гибрида внутри полимеразы, а оставшаяся последовательность нестабильна и комплекс легко диссоциирует. Другой тип последовательностей, называемый ро-зависимый, тоже образует шпильку, но диссоциирует не за счет полиА, а только в присутствии и при участии фактора ро, затрачивающего на это АТР.

Некоторые антибиотики могут блокировать транскрипцию, вызывая ее преждевременную терминацию. Например, актиномицин D, интеркалирует в ДНК между G-C парами, деформируя ДНК, препятствуя движению ДНК-полимеразы.

Синтез мРНК по матрице ДНК еще не вся ее история. Прежде чем смочь выполнять свои функции, РНК-транскрипт должен еще «дозреть», т.е. подвергнуться посттранскрипционной обработке, т.е. процессингу. Вновь синтезированная молекула РНК называется первичным транскриптом. Один транскрипт содержит один ген (у эукариот), однако последовательность, необходимая для синтеза белка, оказывается не непрерывной. Кодирующая последовательность прерывается некодирующими участками, называемыми интронами, тогда как кодирующие участки называются экзонами. В результате процесса, называемого сплайсингом, интроны вырезаются, а экзоны соединяются в непрерывную последовательность, отвечающую полипептиду. У бактерий гены непрерывные, сплайсинга почти нет. Но это еще не всё, последовательность дорабатывается по краям. На 5’ конце добавляется структура, называемая кэп (сар), а на 3’ конце поли(А) хвост длиной 20-250 нт. В конце жизни все РНК подвергаются полному разрушению.

Интронов особенно много у позвоночных, за редким исключением гистоновых белков. Интроны были открыты экспериментально. Если взять ДНК, денатурировать, и потом добавить туда зрелые транскрипты, а затем охладить, получится гибрид. Там будет много петель, соответствующих интронам. У человека на долю интронов приходится гораздо больше ДНК, чем на долю экзонов. Неудивительно найти ген, в котором 50000-200000 нуклеотидов.

Как происходит сплайсинг? Требуется ли для этого АТР, как лигазе для сшивания цепей? Действительно есть один тип интронов, которые вырезаются таким образом (тип IV). Они требуют АТР, белков, подобных лигазам. Но гораздо интереснее, что есть такие типы (I и II), где всё получается само собой. В этом процессе находят отражение каталитические свойства РНК. Первый тип реакции требует гуанозин, в качестве кофактора, но не источника энергии. Он вытесняет один экзон. Потом то же самое делает оторванный экзон, вытесняя интрон. Второй тип реакции не требует кофактора. Интрон замыкается в кольцо. Это автокаталитические реакции. Есть еще III тип, требующий дополнительных белков и РНК.

Дополнительный процессинг имеет место у эукариот на концах РНК. Это 5’-концевой сар и поли(А)-хвост. Функции этих структур понятны только частично, похоже, они помогают защитить РНК от ферментативного гидролиза. Сар образуется путём добавления G через трифосфатную связь и последующее метилирование G и нескольких следующих за ним оснований. Поли(А) хвост образуется в два этапа. Сначала отщепляется некая, можно сказать запасная, последовательность, идущая после сигнала присоединения поли(А) – AAUAAA. Потом к освободившемуся 3’- концу полиаденилат-полимераза присоединяет ААААА (20-250).

Зачем нужны интроны? На первый взгляд – это пустая трата ресурсов. Но если бы они не давали никакой выгоды организму, они бы давно утратились в ходе эволюции. Все первичные транскрипты РНК делятся на простые, из которых получается одна мРНК, и сложные, из которых может получиться несколько различных мРНК. Значит ли это, что из него получится несколько пептидов? Нет, это значит, что есть несколько альтернативных путей процессинга, приводящих к образованию разных мРНК. Например, может быть два сайта отщепления и полиаденилирования, при этом получается две мРНК разной длины. Возможны различные планы сплайсинга, т.е. экзон может становиться интроном.

рРНК и тРНК тоже подвергаются процессингу. рРНК в бактериях записаны в единый транскрипт. Из него удаляются интроны, после чего получается три независимых РНК. В эукариотах 18, 28, 5,8 S РНК тоже режутся из одного транскрипта. В обоих случаях работе нуклеаз предшествует метилирование тех участков, которые потом сохранятся.

тРНК содержат интроны, которые должны удаляться. Несколько тРНК могут быть записаны в одном транскрипте. Помимо вырезания интронов, к 3’ концу присоединяется ССА, к которой потом будет крепиться аминокислота.

Может ли РНК возникать de novo без матрицы. Может! Есть такой фермент полинуклеотид фосфорилаза, который in vitro катализирует реакцию синтеза РНК-подобных полинуклеотидов. Однако, для присоединения нужны не NTP, a NDP, причём для дезокси- это не работает. Последовательность получается случайной, и отражает процентный состав нуклеотидов в смеси. Для чего это клетке? В клетке этот фермент катализирует обратную реакцию, если повысить концентрацию фосфатов, можно получить это и в пробирке. Функция этого фермента – разрушение мРНК и получение дифосфатов.

Экспрессия генов регулируется на многих уровнях. Один из способов регуляции – концентрация соответствующих мРНК в клетке. Концентрация любого вещества определяется соотношением скоростей синтеза и гидролиза, если они равны, концентрация остается постоянной. Скорость распада РНК в клетках может быть очень различной. Время полужизни у РНК позвоночных 3 часа, у бактерий – полторы минуты. Ферменты, разрушающие РНК, называются РНКазы, или рибонуклеазы. Это могут быть экзорибонуклеазы, производящие гидролиз последовательно с конца, например 3’-5’ экзорибонулкеазы. От них может защищать полиА-хвост, с которым часто бывают связаны различные белки. Бывают и эндонуклеазы, которые могут разрезать цепь в каком-то месте.

Поговорим о каталитической функции РНК. РНК-ферменты носят название рибозимы. Это уже знакомые нам интроны I, которые сами себя сплайсируют, и РНКаза Р, отщепляющая 5’ конец у тРНК. Часто субстратом для рибозимов является молекула РНК. Активность рибозимов сильно зависит от их трехмерной структуры. Если их расплавить при высокой температуре или в присутствии денатурирующих агентов, их активность потеряется.

До сих пор во всех наших рассуждениях роль матрицы при синтезе и ДНК, и РНК отводилась ДНК. А может ли быть иначе, и чем РНК хуже ДНК? В принципе, ничем, и ферментов, осуществляющих синтез ДНК и РНК по матрице РНК на удивление много. За одним исключением они играют довольно скромную роль. Исключение это составляют вирусы. Наличие таких ферментов заставляет нас добавить некоторые новые пути в нашем графе, описывающем информационные потоки в клетке. С одной стороны, эти пути имеют прикладное значение в технологии рекомбинантной ДНК (попросту клонировании). С их помощью можно получать ДНК-копии с РНК, так называемые комплиментарные ДНК, (cDNA). Но это даже не главное. Важнее те аргументы, которые они добавляют в пользу РНК, как первой самореплицирующейся молекулы.

Рассмотрим некоторые вирусы, геном которых состоит из РНК. Помимо РНК они содержат фермент РНК-зависимую ДНК-полимеразу, называемый обратной транскриптазой. Сначала он, используя в качестве матрицы однонитиевую вирусную РНК, синтезирует комплиментарную ей «-»- цепь ДНК. Получается гетеродуплекс. Затем, тот же фермент разрушает цепь РНК и синтезирует на ее месте вторую цепь ДНК. Вирусы, использующие такую стратегию, называются ретровирусы. Обратные транскриптазы выполняют три функции: РНК-зависимый синтез ДНК, разрушение РНК и ДНК-зависимый ДНК-синтез. Для синтеза ДНК ей, как и всем, нужен праймер, и такой праймер есть. Он «поставляется в комплекте» в составе вирусной частицы, в виде тРНК, спаренной с вирусной РНК на 3’ конце. У обратных транскриптаз нет способности проверять за собой ошибки, поэтому частота ошибок очень высока (около 20000). В результате эволюция таких вирусов существенно ускоряется.

РНК-зависимая РНК-полимераза служит для репликации РНК вирусных геномов и называется РНК-репликаза. Она встречается в вирусах-бактериофагах.

Вернемся теперь к репликации ДНК. Рассматривая синтез отстающей цепи, мы упустили один момент, а именно синтез концевых участков в линейных молекулах. Так как для начала синтеза нужен праймер, то последние несколько нуклеотидов останутся нереплицированными, и новая цепь окажется укороченной с 5’ конца. Таким образом, в каждом следующем поколении ДНК будет всё короче и короче, пока совсем не утратится. Прокариоты решают эту проблему путём закольцовывания ДНК. У эукариот другой способ. На концах ДНК находятся специальные последовательности, теломеры (от слова “telos” - конец), состоящие из многих повторов одной и той же олигонуклеотидной последовательности типа T_xG_y в одной цепи и C_yA_x в комплиментарной. Специальные ферменты теломеразы постоянно наращивают утрачиваемые концевые фрагменты этой последовательности. Теломеразы, помимо белковой компоненты, содержат еще и РНК длиной около 150 нуклеотидов и содержащую 1.5 копии C_yA_x. По сути дела, теломераза - это обратная транскриптаза, использующая в качестве матрицы свою собственную РНК. Синтез ДНК теломеразой требует наличия короткого праймера T_xG_y и происходит в обычном направлении 5’-3’. Синтезировав одну копию повтора, фермент нужно сдвинуть, чтобы начать снова. Считается, что при этом образуется шпилька из не-Вотсон-Криковских пар G-G. Синтезированная теломеразой цепь образует на конце шпильку из тех же G-G пар и служит праймером для синтеза комплиментарной цепи ДНК-полимеразами.

В соматических клетках у человека теломеразы не работают, и длина теломер линейно уменьшается с возрастом организма. Однако в зародышевых клетках (germ-like) теломеразы работают, и они могут делиться много раз.

Дата добавления: 2014-01-07