Оценка цитотоксических свойств наноматериалов

4.9.1. Оценка цитотоксичности с помощью МТТ

Принцип метода МТТ основан на способности фермента сукцинатдегидрогеназы

митохондриальной мембраны клеток млекопитающих восстанавливать желтую соль 3-[4,5-

диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана фиолетового

цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток. Таким образом, по

интенсивности накопления кристаллов формазана в цитоплазме можно судить об уровне

митохондриального дыхания клетки, что является показателем ее жизнеспособности. Количество

образуемого формазана в клеточном монослое пропорционально имеющемуся количеству живых

клеток. Безопасность наноматериалов оценивают по величине ингибирующего эффекта наночастиц

на пролиферацию и жизнеспособность эукариотических клеток-мишеней.

Выбор клеток-мишеней зависит от предполагаемых биологических эффектов наночастиц,

заявленных их производителями. Чаще всего в качестве клеток-мишеней используют перевиваемые

клеточные культуры: мышиные фибробласты L929, мышиные макрофагоподобные клетки J774.1A или

эпителиальные клетки человека HeLa S3.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Мышиные фибробласты L929 культивируют в ППС на основе

DMEM. Для

эксперимента клетки L929 пересевают в соответствии со

стандартной

процедурой (раздел 4.7.2) в 96-луночный плоскодонный планшет для

культур

клеток в ППС в концентрации 2 x 10 клеток/куб. см по 100 куб. мм в

лунку.

Наноматериалы подготавливают и вводят в культуру клеток, как

описано в

разделе 4.8.1. Образцы наноматериалов разводят в ППС. Обычно при

первичном

исследовании образца используют титрование шагом от

концентрации

10 мг/куб. см до пикограммовых концентраций. Затем раститрованный

образец

добавляют к монослою клеток (по 100 куб. мм в лунку) и

проводят

культивирование клеток в стандартных условиях (37 °C, 5% CO

, 95%

влажности). В качестве контроля используется среда или

растворитель

(носитель) образца (в случае его применения), который также

добавляется

в среду культивирования в той же концентрации, что и в составе

исследуемого

образца наноматериала.

Через 24, 48, 72, 96 и 120 часов после добавления препаратов наноматериалов в каждую лунку

добавляют по 10 куб. мм раствора МТТ в ФСБ (5 мг/куб. см), инкубируют 4 часа и затем вносят 50

куб. мм лизирующего буфера на основе ДСН (таблица 2) для лизиса клеточного монослоя и

растворения фиолетовых кристаллов формазана в цитоплазме клеток. Через 18 ч инкубации при

комнатной температуре определяют интенсивность фиолетового окрашивания по оптической

плотности раствора на планшетном спектрофотометре при длине волны 595 нм. Оценку результатов

теста МТТ проводят путем сопоставления оптической плотности в опытных и контрольных лунках.

Величина оптической плотности пропорциональна количеству живых клеток в лунках. По

изменению оптической плотности судят о цитотоксической активности препарата. Достоверность

разницы оптической плотности по сравнению с контролем определяют по критерию Стьюдента.

Возможное негативное воздействие наноматериала на жизнеспособность клеток считается

выявленным при установлении различия на уровне значимости P < 0,05.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Таблица 2

Дата добавления: 2014-11-25