Лимфоцитов для одной группы мышей

--------------------T-------------T-------------T-------------T------

-------T-------------

¦ Клеточная взвесь ¦ Питательная ¦ ConA ¦ ЛПС

¦ Наноматериал ¦ Наноматериал ¦

¦ 6 ¦ среда ¦ ¦ ¦

(высокая ¦ (низкая ¦

¦ 1 x 10 кл./куб. см ¦ ¦ ¦

¦ концентрация) ¦ концентрация) ¦

+-------------------+-------------+-------------+-------------+------

-------+-------------+

¦ 0,100 куб. см ¦ 0,110 куб. см ¦ ¦

¦ ¦ ¦

+-------------------+-------------+-------------+-------------+------

-------+-------------+

¦ 0,100 куб. см ¦ 0,010 куб. см ¦ 0,100 куб. см ¦

¦ ¦ ¦

+-------------------+-------------+-------------+-------------+------

-------+-------------+

¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ 0,010

куб. см ¦ ¦

+-------------------+-------------+-------------+-------------+------

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

-------+-------------+

¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ 0,100 куб. см ¦

¦ ¦ 0,010 куб. см ¦

+-------------------+-------------+-------------+-------------+------

-------+-------------+

¦ 0,100 куб. см ¦ 0,010 куб. см ¦ ¦ 0,100 куб.

см ¦ ¦ ¦

+-------------------+-------------+-------------+-------------+------

-------+-------------+

¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ ¦ 0,100 куб. см ¦ 0,010

куб. см ¦ ¦

+-------------------+-------------+-------------+-------------+------

-------+-------------+

¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ ¦ 0,100 куб.

см ¦ ¦ 0,010 куб. см ¦

L-------------------+-------------+-------------+-------------+------

-------+--------------

Инкубируют планшет 18 - 24 ч при 37 °C, во влажной атмосфере,

5% CO.

Затем переносят по 0,1 куб. см исследуемых биологических

образцов в

соответственно промаркированные пробирки для цитометрического

анализа

FALCON.

После чего добавляют в пробирки по 1 куб. мм моноклональных флюорохром-конъюгированных

антител: CD3 PerCP, CD19 APC, CD69 FITC. В отдельную пробирку добавляют 1 куб. мм

изотипического контроля IgG1-FITC. Аккуратно перемешивают пробирки на вортексе в течение 10

сек. и помещают в темное место при комнатной температуре (18 - 20 °C) на 20 - 30 минут.

Затем лизируют эритроциты. Для этого в каждую пробирку вносят по 1 куб. см 1 X Facs Lysing

Solytion (BD), аккуратно перемешивают на вортексе в течение 10 сек., инкубируют 10 - 12 минут в

темноте при комнатной температуре (18 - 20 °C).

Затем осаждают лейкоциты центрифугированием при 300 g 5 минут. Удаляют надосадочную

жидкость. Дважды отмывают лейкоциты в ФСБ (300 куб. мм), 400 g, 5 минут.

Затем фиксируют лейкоциты. Для этого ресуспендируют клеточную взвесь, вносят в каждую

пробирку по 500 куб. мм 1% раствора параформальдегида и встряхивают клетки на вортексе. Анализ

проводят на проточном цитофлюориметре в программе Cell Quest Pro. Меченные моноклональными

антителами образцы можно хранить при температуре 4 °C (в холодильнике) 24 часа.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Оценку негативного действия наноматериала ex vivo на функциональную активность T- и B-

лимфоцитов проводят на основании сравнения количества митоген-активированных CD69-

позитивных T- и B-лимфоцитов, выделенных из групп контрольных (интактных) мышей и

обработанных анализируемым наноматериалом. Достоверное уменьшение T- и B-лимфоцитов,

несущих на своей поверхности CD69 рецептор, после стимулирования соответствующим митогеном,

свидетельствует о снижении функциональной активности лимфоцитов. Спонтанное увеличение у

мышей, обработанных наноматериалом (по сравнению с интактными), CD69 позитивных T- и B-

лимфоцитов после культивирования клеток в среде свидетельствует о гиперактивации клеток

иммунной системы.

Оценку негативного действия наноматериала in vitro проводят на основании сравнения

количества CD69-позитивных T- и B-лимфоцитов, стимулированных соответствующим митогеном в

присутствии и без наноматериала в среде. Снижение уровня экспрессии CD69 рецептора на

поверхности митоген-активированных T- и B-лимфоцитов в присутствии наноматериала в среде, по

сравнению с количеством CD69-позитивных митоген-активированных T- и B-лимфоцитов без

добавления наноматериала в среду, свидетельствует о нарушении функциональной активности

лимфоцитов.

4.11.3. Оценка апоптотической и пролиферативной активности лейкоцитов

Апоптоз лимфоцитов - важнейший механизм иммунорегуляции от момента созревания и

дифференцировки иммунокомпетентных клеток до этапа реализации механизмов врожденного и

адаптивного иммунитета. Отсутствие адекватного апоптоза сопровождает лимфопролиферативную

патологию. Усиление апоптоза лимфоцитов является причиной формирования иммунологической

недостаточности. При проведении тестирования определяют процент апоптотических клеток в

селезенке мышей после обработки их наноматериалом согласно разделам 4.2 и 4.3.

Спленоциты, выделенные из групп контрольных мышей и групп,

обработанных

анализируемым наноматериалом, согласно разделу 4.7.1, разводят в

среде

RPMI-1640 до концентрации 10 кл./куб. см и в объеме 0,1 куб. см

помещают в

пробирки для проведения цитометрического анализа (например,

Falkon).

Отмывают в ФСБ 1 раз. Клетки фиксируют охлажденным до 4 °C 70°

этиловым

спиртом в течение не менее 1 часа (можно оставить препарат в

фиксаторе до

24 ч). Спирт добавляют по каплям, тщательно перемешивая

лейкоцитарную

взвесь, во избежание образования конгломератов. Фиксированные

образцы

центрифугируют при 400 g 5 мин. Супернатант удаляют.

Тщательно перемешивают лейкоцитарную взвесь и добавляют пропидий йодид в концентрации

5 мкг/куб. см в 0,2 куб. см в ФСБ, содержащем 0,1% тритона Х-100, 0,005 куб. см раствора РНК-азы и

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

0,1% азид натрия. Пробы перемешивают, инкубируют в темноте 1 час при комнатной температуре.

Анализ проводят на проточном цитофлюориметре (FACSCalibur, BD или аналог) с аргоновым

лазером при длине волны 488 нм в программе Cell Quest.

Анализируют 10000 клеток, среди которых определяют процент гиподиплоидных

(апоптотических) и пролиферирующих клеток с использованием программы Cell Quest.

Цитотоксичными считаются наноматериалы, индуцирующие после иммунизации животных

апоптоз более чем у 10% спленоцитов или снижающими до 15% количество пролиферирующих

клеток.

4.11.4. Оценка цитотоксического действия наноматериалов на лейкоциты периферической

крови человека

Оценку цитотоксичности наноматериалов in vitro в методе проточной цитофлуориметрии

проводят с использованием красителя 7-AAD (7-амино-актиномицин D). 7-AAD может

использоваться вместе с флюорохромами ФИТЦ (флюоресцеин изотиоционат) и PE (фикоэритрин).

Одновременное окрашивание клеток CD45 ФИТЦ (маркер всех кроветворных клеток лейкоцитов) и

7-AAD позволяет точно оценить количество жизнеспособных клеток.

Анализ проводят следующим образом. Разведения культуры донорских лейкоцитов человека,

полученных согласно разделу 4.7.1, вносят в лунки 96-луночного планшета по 100 куб. мм. Схема

эксперимента представлена в таблице 4.

Таблица 4

СХЕМА АНАЛИЗА ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НАНОМАТЕРИАЛОВ

Дата добавления: 2014-11-25