Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Теоретичні відомості. Тема: Фотометрія та фотометрична апаратура




Тема: Фотометрія та фотометрична апаратура. Визначення концентрації розчинних білків з біуретовим реактивом та біуретовим реактивом в модифікації Ярош

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА №3

Висновок

 

ЛІТЕРАТУРА

1. Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з курсу «Хімія біологічно активних речовин», С. 3-9.

2. Биохимия./ Н.Е. Кучеренко, Ю.Д. Бабенюк, А.Н. Васильев и др.- К.: Выща школа, 1988.- С.78-107, 295 – 340.

3. Основы аналитической химии./ Ю.А.Золотов, Е.Н.Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под ред. Ю.А.Золотова.- М.: Высшая школа, 2000.

4. Инструментальные методы химического анализа./ Г.Юинг.- М.: Мир,1989.

(4 години)

 

Мета: Навчитися розраховувати концентрацію речовин на підставі

результатів фотометричних досліджень, будувати калібрувальний графік та обирати світлофільтр.

1. Світло — це електромагнітні хвилі видимого спектру. До видимого діапазону належать електромагнітні хвилі в інтервалі частот, що сприймаються людським оком (7.5×1014 — 4×1014 Гц), тобто з довжиною хвилі від 400 до 760 нанометрів (див. малюнок нижче). У фізиці термін «світло» має дещо ширше значення і є синонімом до оптичного випромінювання, тобто включає в себе інфрачервону та ультрафіолетову області спектру. Джерело світла (як природнього, так і штучного) можна представити як джерело, що випромінює частинки енергії. Ці частинки називаються квантами світла або фотонами. Енергія фотона залежить від довжини хвилі випромінюваного світла. Одиницею виміру довжини хвилі служить нанометр (нм).

 

Середня частина спектра сонячного світла це:

· ультрафіолетові промені;

· видиме випромінювання;

· інфрачервоне випромінювання.

 

Ультрафіолетові промені - цей спектр розміщений перед видимою частиною світла. Людське око не має рецепторів, які могли б сприймати ультрафіолетові промені, так само як і інфрачервоні. Довжина хвиль ультрафіолетового спектру лежить в діапазоні 10 - 400 нм.

 

Видиме випромінювання - спектр, який сприймається людським оком та лежить в діапазоні довжини хвиль 400-760 нм.

 

 

 

Видимий спектр складається з різних кольорів і кожному з них відповідає певний діапазон довжини хвиль, а саме:

 

фіолетовий - 400-440 нм
синій - 440-490 нм
блакитний - 490-510 нм
зелений - 510-565 нм
жовтий - 565-595 нм
помаранчевий - 595-620 нм
червоний - 620-760 нм

 

Інфрачервоне випромінювання - його ще називають тепловими променями. Довжина хвиль інфрачервоного діапазону понад 760 нм.

Біохімічні аналітичні методи частіше всього закінчуються кольоровою

реакцією, в результаті якої прозорий розчин набуває забарвлення, тобто здатність вибірково поглинати (адсорбувати) світло з певною довжиною хвилі.

Для аналізу використовують тільки ті кольорові реакції, в яких розвивається забарвлення, пропорційне концентрації досліджуваної речовини. За допомогою фотометрії визначають екстинцію, або оптичну густину розчину. Більшість фотометричних приладів побудовано так, що вони безпосередньо вказують на цю величину. Фотометричні прилади поділяються на 2-і великі групи: фотометри і спектрофотометри.

В фотометрах необхідні спектральні діапазони виділяються за допомогою світлофільтрів, тому число ділянок спектра, в якому може проводитись вимірювання, дорівнює числу світлофільтрів.

В спектрофотометрах ділянки спектра виділяються за допомогою призм або дифракційних грат, тому можна встановити любу довжину хвилі в

заданому діапазоні. Зазвичай спектрофотометри – це прилади більш високого

класу, ніж фотометри, в них можна виділити більш вузьку (більше монохро- матичну) ділянку спектра, проте все залежить від конкретної конструкції приладу.

1.1 Принцип роботи ФЕК

Фотоелектроколориметр застосовується для визначення концентрації

забарвлених розчинів за їх здатностю до світлопропускання (оптична густина).

Прилад працює від мережі змінного струму. В якості джерела світла в приладі використовують лампу “Л” розжарювання (для роботи у видимій частині спектру) та ртутно-кварцеву лампу високого тиску (для вимірювання в ультрафіолетовій частині спектру).

 

 

Принципова схема будови приладу:

В основу роботи приладу покладено принцип порівняння інтенсивності

двох пучків світла при допомозі щілинної діафрагми "Д". Світлові пучки від

лампи "Л" відображуються від дзеркала "З1" і "З2", проходять через світло- фільтри "С1" та "С2" (забезпечують таку довжину хвилі, до якої фотоеле менти найбільш чутливі), кювети "А1" та "А2" (з досліджуваним забарвленим розчином та розчином порівняння) і потрапляють на фотоелементи "Ф1" та "Ф2", які підключені до гальванометра (Г). Внаслідок поглинання світла забарвленим досліджуваним розчином, що знаходиться в кюветі "А2", на фотоелемент "Ф2" буде потрапляти пучок світла меншої інтенсивності, ніж на фотоелемент "Ф1", і стрілка гальванометра буде відхилятися. Величину послаблення світлового потоку показує зв’язаний з щілинною діафрагмою "Д" відрахунковий барабан. Виражається вона в одиницях оптичної густини (екстинкція), величина яких прямо пропорційна концентрації досліджуваної речовини в розчині.

Користуючись калібрувальним графіком, по екстинції відрахункового

барабану визначають невідому концентрацію речовини в досліджуваному

розчині. Для побудови калібрувальної кривої вимірюють оптичну густину ряду розчинів досліджуваної речовини з відомими концентраціями.

 

1.2 Вибір світлофільтрa

Якщо виникають труднощі у виборі світлофільтру, що найбільш підходить для проведення фотометричних досліджень, розчин наливають у кювету та вимірюють його абсорбцію за допомогою усіх наявних у наборі світлофільтрів. Керуючись описаними правилами, будують криву, відкладаючи на горизонтальній вісі довжину хвиль (у нм), а на вертикальній – знайдені при їх застосуванні значення оптичної щільності. Відзначають на графіку ділянку лінії, що відображає найбільшу величину абсорбції та розташовується приблизно паралельно горизонтальній вісі. Орієнтуючись на неї, і обирають необхідний світлофільтр. Із двох близьких за областями пропускання світлофільтрів обирають той, при роботі з яким чутливість приладу (оцінюється за максимальним значенням абсорбції) є найвищою.

1.3 Оцінка результатів за калібрувальною кривою

Градуювальна (калібрувальна) крива відображає тісну залежність між абсорбцією (А), що називається також оптичною щільністю (D) або екстинкцією (Е) та концентрацією (С) речовини в серії стандартних розчинів.

Стандартні розчини повинні готуватися із особливо ретельно з

наважки, отриманої на терезах дуже точного зважування (наприклад,

аналітичних). Слід також звернути увагу на те, щоб стандартні речовини

мали високий ступінь чистоти та достатню стабільність, не були гігроскопічними і не взаємодіяли із газами повітря.

Наважка повинна бути достатньо великою, що дозволяє зменшити технічну помилку під час зважування. Цьому сприяє зважування стандартної речовини не у звичайному важкому бюксі, а на поліетиленовій або ж на целофановій плівці із подальшим кількісним повним перенесенням речовини у відповідний скляний мірний посуд. Речовина перед зважуванням має бути висушеною до постійної маси у сушильній шафі при температурі 110 °С.

Мірний посуд, що використовується для отримання стандартних

розчинів, необхідно попередньо ретельно знежирити та вимити. Не

рекомендується сушити мірний посуд у сушильний шафі, оскільки за високої

температури змінюється її об’єм та порушується градуювання.

Побудова калібрувальної кривої починається із приготування

арифметичного ряду розведень із подальшою обробкою стандартних розчинів аналогічно дослідним пробам.

Розведення стандартної речовини повинні не тільки охоплювати діапазон фізіологічних концентрацій, але й виходити за межі їх мінімальних та максимальних величин. У більшості випадків ряд калібрувальних розчинів отримують шляхом розбавлення основного (маточного) розчину. Відомо, що чим концентрованішим є розчин стандартної речовини, тим довше вона

зберігається у ньому.

Сутність побудови калібрувальної кривої зводиться до того, що певні

об’єми розчинів серії стандартних проб обробляються в умовах, повністю

ідентичних до таких під час аналізу дослідних проб.

Залежність між двома співставними величинами відображається лінією, що може бути побудована уже за трьома точками заміру. Проте, побудову калібрувального графіку слід вести не менше, ніж за 5 точками.

Калібрувальна крива прокладається таким чином, щоб, за можливістю, більша кількість точок (наприклад, 3 або 5) розташовувалися на лінії, а решта – поблизу неї, рівномірно відхиляючись в один та інший бік. Окремі точки, що значно відхиляються від калібрувальної кривої, що звичайно є наслідком грубих помилок під час визначення, виключаються із обліку.

Розташування кривої має бути таким, щоб вона виходила із нульової

відмітки під кутом приблизно 45° до осей координат, адже за таких умов

досягається найбільша точність вимірювань. Цьому сприяє також вибір

достатньо великого масштабу.

У правому верхньому куті аркуша із калібрувальним графіком вказують:

назву калібрувальної кривої, метод дослідження, довжину хвилі (номер

світлофільтра), довжину оптичного шляху (у мм), дату побудови

калібрувальної кривої. Враховують також, що у більшості фотометрів

найбільш оптимальною є область досліджень у межах 0,1-0,3 (максимум – 0,7) од. абсорбції.

Правильна побудова калібрувальної кривої залежить від умов,

що можуть впливати на її розміщення відносно осей системи координат, тобто, на порушення прямої залежності між концентрацією та величиною екстинкції:

- наявність у середовищі електролітів, що змінюють структуру молекул

речовини або ж забарвлених розчинів;

- гідратація (сольватація), що впливає на поглинання розчином світлового

потоку, адже зі зміною концентрації розчину змінюється і сам цей процес;

- неповна взаємодія досліджуваної речовини із реактивом при його розбавленні;

- зміни рН розчину, що впливає на повноту утворення та склад молекул

забарвленої речовини.

 

2. Білки це біологічно активні речовини, що відіграють ключову роль в життєдіяльності клітин живої матерії. Неможливо оцінити загальну кількість білкових молекул в царстві живої природи, враховуючи велику різноманітність живих організмів. Наприклад, клітина мікроорганізму Escherichia coli містить більше 3000 різних білків.

До складу білків входять вуглець, водень, азот, кисень, сірка. В деяких білках присутні такі елементи як фосфор, залізо, цинк, мідь, молібден. Активні центри ферментів можуть мати кілька молекул рідкісних металів таких як ванадій. Білки мають велику молекулярну масу, але при кислотному гідролізі утворюють ряд простих, низькомолекулярних сполук, що відносяться до класу a-амінокислот.

В білкових молекулах послідовно розташовані амінокислотні залишки ковалентно пов¢язані пептидними зв¢язками один з одним, утворюючи довгі нерозгалужені полімерні ланцюги. Пептидні зв¢язки утворюються в результаті вилучення молекули води з карбоксильної групи однієї амінокислоти і a -аміногрупи іншої (-СО-NН-). Такі полімерні молекули називаються поліпептидними ланцюгами і можуть мати сотні амінокислотних залишків. Молекула білку може складатися з одного або кількох поліпептидних ланцюгів.

 

2.1 Кількісне визначення концентрації білків

Кількісне визначення концентрації білків у білковому розчині може бути проведене різними методами:

1. Визначення азоту (метод К¢єльдаля). Метод заснований на повній

руйнації молекул білку під дією сірчаної кислоти у присутності каталізатора. Метод вимагає великої кількості білку та значних затрат часу.

2. Амінокислотний аналіз. В цьому методі зразок білку піддається

повному гідролізу та визначенню амінокислотного складу.

3. Колориметричні методи. Досить прості у відтворенні, потребують

невеликої кількості білку (Біуретовий метод, метод Лоурі).

4. Метод Варбурга та Христіана базується на визначенні співвідношення

величини поглинання при 280 та 260 нм.

5. Флуориметричні методи.

 

Ми розглянемо методи визначення концентрації білку в розчині з біуретовим реактивом, з біуретовим реактивом в модифікації Ярош та за методом Лоурі.

1. Визначення концентрації розчинного білку з біуретовим реактивом

Принцип методу. Біуретова реакція обумовлена наявністю в молекулі білків пептидних зв'язків, які в лужному середовищі утворюють комплексні сполуки з іонами Си2 + з утворенням продукту фіолетового кольору, інтенсивність якого пропорційна вмісту білка в середовищі. Діапазони вимірювань від 5 до 100 г/л.

 

Для визначення концентрації білку невідомого розчину спочатку необхідно побудувати калібрувальну криву. Для побудови такої кривої застосовуються стандартні білки. В якості стандарту можна використати альбумін сироватки крові бика. Перед приготуванням стандартного розчину альбумін висушують в вакуумі при 600С до постійної маси. Готують розчин білку концентрації 500 мкг/мл. З цього розчину готують кілька розведень менших концентрацій (не менше 5 точок).

Для кожного розведення визначають оптичну щільність (∆D). Відкладаючи на осі абсцис концентрацію білку, а на осі ординат значення ∆D, що відповідає цій концентрації. Будують калібрувальну криву.

Для визначення концентрації білку в невідому розчині готують певне розведення такого білку і, згідно методики, вимірюють ∆D для цього розчину. Потім на калібрувальній кривій відмічають це значення ∆D і визначають концентрацію білку в невідомому розчині з урахування величини розведення.

 

Самостійна робота студентів

1. Для побудови калібрувального графіка приготувати стандартний розчин альбуміну.

2. З стандартного розчину альбуміну з концентрацією 100 мг/мл приготувати робочі розчини (для кожної концентрації зробити 3 розчини).

3. Виміряти оптичну щільність кожної концентрації за допомогою біуретової реакції проти контрольної проби, що містить замість розчину білку фізіологічний розчин.

3. Побудувати калібрувальну криву.

4. Визначити концентрацію білків невідомих розчинів

5. Написати висновок




Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2015-05-23; Просмотров: 1994; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.011 сек.