Дослід 1. Оцінка ступеня ендогенної інтоксикації за методом М.Я. Малахової

Практична робота

Теоретичні питання

Тема № 7. Дослідження процесів біотрансформації каенобіотиків та ендогенних токсинів. Мікросомальне окиснення, цитохром Р-450.

Мета заняття: Вміти трактувати біохімічні механізми функціонування детоксикаційної системи печінки: реакції мікросомального окиснення та кон’югації в біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів. Вміти пояснювати біохімічні основи розвитку недостатності функцій печінки за умов хімічного, біологічного та радіаційного ураження.

Актуальність теми: У печінці знешкоджуються ендотоксини та ксенобіотики, які є чужорідними для нормальних метаболічних шляхів, можуть змінювати і порушувати перебіг обмінних процесів, а в умовах перебігу патології лікарські засоби можуть нормалізувати метаболізм і тим самим зумовити видужування хворого Знання кінетики всмоктування, транспорту, розподілу, метаболізму речовин в організмі є основою для розробки лікарських форм із заданими властивостями.

1. Детоксикаційна функція печінки; біотрансформація ксенобіотиків та ендогенних токсинів.

2. Типи реакцій біотрансформації чужорідних хімічних сполук у печінці.

3. Реакції мікросомального окиснення; індуктори та інгібітори мікросомальних монооксигеназ.

4. Реакції кон’югації в гепатоцитах: біохімічні механізми, функціональне значення.

5. Електронно-транспортні ланцюги ендоплазматичного ретикулуму. Генетичний поліморфізм та індуцибельність синтезу цитохрому Р-450.

6. Виникнення і природа розвитку толерантності до лікарських засобів.

Молекули середньої маси (за класифікацією М.Я. Малахової) складаються з 2-х груп сполук – речовин низької (РНММ) і середньої молекулярних мас (РСММ) і олігопептидів (ОП), що мають молекулярну масу меншу 10 кДА. РНММ і РСММ – це речовини небілкової природи: креатинін, сечовина, олігоцукри, молочна кислота, білірубін, амінокислоти, холестерин, продукти пероксидного окиснення ліпідів та ін. До ОП входять регуляторні пептиди (нейротензини, соматостатин, вазоактивний інтестинальний пептид, енкефіліни та інші біологічно активні речовини (БАР). Перераховані вище сполуки – це фізіологічні компоненти, які входять в поняття «молекули середньої маси» (МСМ). Патологічними компонентами є продукти некерованого протеолізу і деструкції органів тканин, мікробні токсини, гідропероксиди, поліаміни, а також збільшення концентрації фізіологічних компонентів.

Накопичення великої концентрації МСМ і порушення їх розподілення між плазмою і еритроцитами, а також порушення їх виділення нирками, викликаними різними етіологічними факторами, призводить до розвитку ендогенної інтоксикації організму.

А) Визначення РНММ і РСММ за методом М.Я. Малахової:

Принцип методу: Полягає в реєстрації неосаджених ТХО компонентів плазми і еритроцитів в діапазоні довжин хвиль 238-300 нм.

Матеріальне забезпечення: 15 % розчин трихлорацетатної кислоти (ТХАК); 0,9% розчин хлориду натрію; дистильована вода; спектрофотометр; центрифуга.

Хід роботи: Для дослідження використовують плазму і еритроцити. Послідовність проведення етапів дослідження наведена в таблиці. Проби перемішують і визначають екстинкцію (Е) в діапазоні 238-300 нм з інтервалом 4 нм на спектрофотометрі проти контролю в кюветі з товщиною шару 10 мм.

Визначення РНММ і РСММ

	Досліджувані проби
Реактив і матеріал	Контроль (мл)	Плазма (мл)	Еритроцити (мл)
Плазма		1,0
Еритроцити			0,5
Розчин NаСІ 0,9%			0,5
Н2О	1,0

Проби енергійно струшують

Розчин ТХАК 15%

0,5

0,5

0,5

Проби перемішують і через 5-7 хв центрифугують при 3000 об/хв. 30 хв.

Надосадова рідина	0,5	0,5	0,5
Н2О	4,5	4,5	4,5

Розрахунок проводять шляхом множення суми отриманих значень екстинкції на крок довжини хвилі.

РНММ і РСММ {плазми, еритроцитів}= (А₂₃₈ + А₂₄₂ + А₂₄₆ + …. + А₃₀₀) х 4 (ум.од.)

Нормативні величини:

	Плазма (ум од.)	Еритроцити (ум.од.)
Чоловіки	10-11	18,7-27,7
Жінки	8,2-9,8	18,9-21,7

Б) Визначення концентрації ОП за методом Лоурі і співавт.

Принцип методу. Принцип методу полягає в утворенні кольорових продуктів синього кольору в результаті 2-х послідовних реакцій: а) біуретової реакції білка з іонами міді в лужному середовищі; б) реакції відновлення фосфорно-молібденовою і фосфорно-вольфрамовою солями реактива Фоліна амінокислот тирозину і триптофану, що присутні в досліджуваному білку.

Матеріальне забезпечення: 1) 0,1 н розчин їдкого натрію; 2) 2 % розчин карбонату натрію; 3) 1 % розчин цитрату натрію; 4) сульфат міді (0,5 г сульфату міді розчинити в 100 мл розчину цитрату натрію); 5) робочий лужно-мідний розчин: 1 мл реактиву № 2 змішують з 50 мл реактиву № 4, готують в день визначення; 6) реактив Фоліна-Чокалтеу: в круглодонну колбу поміщають 10 г Nа₂WО₄ · 2 Н₂О, Nа₂МоО₄ · 2 Н₂О, додають 70 мл Н₂О, перемішують. До отриманого розчину додають 5 мл 85 % розчину фосфатної кислоти і 10 мл концентрованої соляної кислоти, колбу приєднюють до зворотнього холодильника і кип’ятять протягом 10 год. Потім у розчин додають 15 г Lі₂SО₄, 5 мл Н₂О і 1 краплю брому. Після охолодження доводять водою до 100 мл і фільтрують. Для отримання робочого реактиву отриманий розчин розводять таким чином, щоб був 1 н розчин. Кислотність робочого розчину визначають титруванням розведеного в 10 разів основного реактиву 0,1 н розчином лугу в присутності фенолфталеїну. Реактив зберігають в скляній посудині тривалий час; 7) 15 г ТХАК розчиняють в 100 мл води; 8) стандартний розчин альбуміну 0,25 мг/мл; спектрофотометр.

Хід роботи: Розведена в 10 разів надосадова рідина, отримана для визначення РНММ і РСММ використовується і для виявлення ОП. Послідовність проведення етапів дослідження наведена у таблиці:

Визначення ОП

Реактив і матеріал	Контрольна проба (мл)	Стандартні проби (мл)	Дослідна проба (мл)
Надосадова рідина				1,0
Н2О	1,0	0,5	-
Стандартний розчин альбуміну 0,25 мг/мл		0,5	1,0
Лужно-мідний розчин	2,0	2,0	2,0	2,0

Інкубація 10 хв при кімнатній температурі.

Робочий розчин Фоліна-Чокалтеу

0,2

0,2

0,2

0,2

Через 30-40 хв визначають екстинкцію на спектрофотометрі при довжині хвилі 750 нм в кюветі з товщиною шару 5 мм проти контролю.

Розрахунок ОП проводять за стандартним розчином. Концентрацію ОП розраховують, зробивши перерахунок на розведення в 1 л розчину.

Нормативні величини:

	Плазма (г/л)	Еритроцити (г/л)
Чоловіки	0,44-0,51	0,78±0,02
Жінки	0,34-0,49	0,72-0,83

В) Визначення інтегрального індекса ендогенної інтоксикації (ІІЕІ) за методом М.Я. Малахової.

ІІЕІ = [(РНММ і РСММ) _плазми х ОП _плазми ] + [(РНММ і РСММ) _еритр. х ОП _{еритроцитів}]

Оцініть отриманий результат.

Клініко-діагностичне значення. Визначення РНММ, РСММ і ОП, а також розрахунок показників, що характеризують ендогенну інтоксикацію, рекомендують для оцінки ступеня важкості захворювання, для призначення адекватної терапії, для контролю за ефективністю лікування.

Інтегральний індекс ендогенної інтоксикації (ІІЕІ)маєтісну кореляцію з летальністю хворих. У нормі його доля в плазмі – 5,0, в еритроцитах 15,5, в загальному ІІЕІ = 20,5±0,3 (ум.од.)

Дата добавления: 2015-05-24