III. Бактериологические методы

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств.

При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS.

Окраска материала по Цилю-Нильсену - наиболее употребимый метод окраски М. tuberculosis. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, размерами не превышающий размер покровного стекла; наливают на бумагу фуксин Циля и осторожно нагревают его на горелке до появления пара, после чего оставляют препарат, чтобы он немного остыл. Затем снимают бумагу с фуксином, ополаскивают препарат водой, опускают в стаканчик с 5% р-ром серной кислоты или смесью 10 частей спирта с 1 частью соляной кислоты, прополаскивают до обесцвечивания. Тщательно промывают водой. Докрашивают любым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин. Мазок, окрашенный по Цилю-Нильсену, вместо докрашивания метиленовым синим можно протравить насыщенным раствором пикриновой кислоты (по Шпенглеру). Палочки, устойчивые к кислоте и спирту, окрашиваются в красный цвет, все остальные микроорганизмы - в синий. Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин. Если в окрашенном мазке содержится не менее 5 микобактерий в одном поле зрения (принято смотреть 100 полей), вероятность высева очень высока.

Наряду с мазком в развитых странах "золотым стандартом" считают посев мокроты на элективные среды (Лёвенштайна-Йенсена и др.) и определение чувствительности к туберкулостатикам. Но это уже обязанность бактериологических лабораторий, наиболее профессионально работающих при ПТД или учреждениях Госсанэпиднадзора. Сильная бактериологическая служба при неинфекционных больницах скорее исключение, чем правило.

Посев материала на среду Лёвенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4-8 нед. Современные методы с использованием высокоселективных сред позволяют выращивать культуры за 1-2 недели, но идентификация микроорганизма требует дополнительного времени. Современную технику посева считают очень информативной и в развитых странах в настоящее время не проводят биологические пробы с заражением морских свинок. М. tuberculosis обладает свойством вырабатывать ниацин, что отличает её от других микобактерий. Для более быстрой идентификации микобактерий разработаны методы гибридизации нуклеиновых кислот.

Если культура выделена, можно определить тип возбудителя и его чувствительность к антибактериальным препаратам. Для дифференциации возбудителя особенно важно определять термостабильность каталазы, поскольку это свойство отсутствует только у М. tuberculosis и М. bovis, наиболее патогенных и вирулентных для человека.

Чувствительность микобактерий к антибактериальным препаратам оценивают с помощью различных методов.

• Диско-диффузионный метод - простейший из них. В агар инокулируют взвесь тестируемого микроорганизма, затем на агар накладывают диск, содержащий антибиотик, а чувствительность определяют посредством измерения зоны подавления роста (оценивают в миллиметрах). Этот метод чаще применяют для определения чувствительности неспецифической флоры, а не микобактерий.

• Во фтизиатрии чаще применяют метод разведения, относимый к стандартизованным методам тестирования in vitro. Микроорганизм инокулируют в тестируемую среду (агар или бульон) и используют серийные двойные разведения антибиотика. Чувствительность определяют измерением концентрации антибиотика, угнетающей рост микобактерий. Таким образом можно определить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) - наименьшую концентрацию в серии двойных последовательных разведении антибиотика, полностью подавляющую видимый рост микроорганизмов.

• В последние годы распространение получил метод оценки чувствительности бактерий с использованием Е-тестов. Е-тестом называют пластиковую полоску с нанесённым стабильным градиентом концентрации антибиотика. Полоску помещают на агар с инокулированной взвесью микроорганизмов, как и при диско-диффузионном методе. Немедленное высвобождение антибиотика из Е-теста создаёт стабильный градиент вдоль оси полоски. Соответственно концентрации антибиотика вдоль полоски располагается эллипсовидная зона отсутствия роста колоний, позволяющая считывать со шкалы Е-теста значение МИК. В отличие от диффузии с дисков, Е-тест - стандартизированный количественный метод.

Пороговые значения для определения устойчивости: для изониазида - 1 мкг/мл, для рифампицина - 20 мкг/мл, для стрептомицина - 10 мкг/мл, для канамицина - 30 мкг/мл, для виомицина - 30 мкг/мл, для этамбутола - 5 мкг/мл, для этионамида и протионамида - 30 мкг/мл, для циклосерина - 50 мкг/мл, для ПАСК - 10 мкг/мл, для тиоацетазона - 2 мкг/мл. В последних руководствах чаще можно встретить следующие критерии устойчивости (табл. 4-2).

• В настоящее время разработаны коммерческие тестовые системы для определения чувствительности in vitro, основанные на методах диффузии и разведения (bioMeriex, Франция; Roche2 Diagnostics2, Швейцария; Giles2 Scentific2, США и др.). Эти тесты в России пока практически недоступны. Многие современные коммерческие тесты используют также ДНК-полимеразный метод (полимеразную цепную реакцию, ПЦР-метод), позволяющий обнаруживать в исследуемом материале буквально считанные микобактерий (10-1000 особей) путём идентификации участка ДНК и его многократного повторения (амплификации). Результат исследования может быть получен в течение 2-х часов. Несмотря на то, что уже имеются коммерческие тест-системы Amplicor2 и Genprobe2, пока широкого распространения ПЦР-метод ещё не получил.

Табл. 4-2. Критерии устойчивости к противотуберкулёзным препаратам (мкг/мл)

Препараты	Минимальная эффективная концентрация
	Жидкая среда	Плотная среда
Изониазид
Рифампицин
Стрептомицин
Этамбутол
Протионамид
Канамицин
Флоримицин
Циклосерин
Тиоацетазон

Правила сбора мокроты. Важную роль в микробиологической диагностике как туберкулёза, так и других бронхолёгочных заболеваний играет правильный сбор мокроты. Если медицинский работник не обучит больного грамотно откашлять и собрать мокроту, эффективность бактериологического выявления туберкулёза снижается.

Больной должен почистить зубы, тщательно прополоскать рот, сплюнуть носоглоточную слизь и слюну, откашлять и собрать только содержимое дыхательных путей.

Если у больного мало мокроты, можно с вечера назначить бромгексин, амброксол или АЦЦ, либо собирать мокроту в течение суток при условии, что ночью она будет храниться в холодном месте (без замерзания), а утром вместе с утренней порцией будет доставлена в лабораторию.

Если мокрота не отходит вовсе, применяют провоцирующую ингаляцию (1502 г NaCI2 и 102 г NaHCO2₃ растворить в 1 л воды) в течение 10-15 мин.

У детей исследуют промывные воды желудка, взятые толстым зондом натощак.

Утреннюю порцию мокроты необходимо доставить в лабораторию в тот же день. В условиях жаркого климата при транспортировке мокроту заливают двойным объёмом одного из консервантов (глицерин, 2% борная кислота, фосфат натрия). Для того чтобы быть уверенным, что в лабораторию направлена мокрота, а не слюна, препарат, окрашенный по Граму, должен отвечать следующим требованиям:

менее 102 эпителиальных клеток на 100 просчитанных (иначе это материал из ротоглотки);

соотношение нейтрофилы/эпителиальные клетки оставляет 25/100 2и более;

преобладание микроорганизмов одного морфологического типа (80% 2всех микроорганизмов в нейтрофилах и вокруг них).

Образцы для микробиологических исследований берут также при назотрахеальной аспирации. Прекрасным материалом для мазка и посева служит аспират желудочного содержимого, взятого рано утром. Хотя непатогенные микобактерии иногда встречаются в желудочном аспирате, их количество крайне мало и не мешает диагностике туберкулёза.

Бронхоскопия - высокоинформативный метод в диагностике туберкулёза, но использование её при взятии микробиологических образцов оправдано только при многократных неудачных попытках получения материала более простыми способами у больных с неясным диагнозом.

Вероятность положительного результата исследования мазка или посева непосредственно связана с протяжённостью и характером поражения лёгких Приблизительно третья часть пациентов с бактериовыделением может быть выявлена при первичной микроскопии окрашенного мазка мокроты. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение нескольких дней, диагностика бактериовыделения повышается до двух третей. Нет необходимости использовать более пяти проб мокроты.

При ограниченных формах лёгочного туберкулёза приблизительно третья часть пациентов будет иметь отрицательный мазок мокроты даже после многократных исследований.

В настоящее время происходит изменение системы выявления и лечения туберкулёза. Реальную помощь предлагает Фонд Сороса. Его сотрудники провели экономический анализ существующих программ. По их данным, стоимость выявления одного больного при проведении массовых обследований посредством флюорографии составляет около $4000, а бактериологически с применением мазка - $1500. Эти цифры обосновывают рациональность внедрения DOTS в условиях сложной экономической ситуации.

Дата добавления: 2015-05-08