КАТЕГОРИИ: Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748) |
Теоретические основы и практические методы разбавления и хранения спермы с/х ж-х
Оценка качества спермы на пунктах искусственного осеменения. На пунктах искусственного осеменения оценивают только активность движения спермиев. Для проверки кач-ва спермы, сохраняемой при т. 2-5°С, открывают термос, берут из флакона каплю спермы, кладут на предметное стекло и исследуют под микроскопом подвижность спермиев. Пробу надо брать быстро, чтобы не допускать нагревания спермы. Исследуют сперму при т. 40-41°С, для этого используют обогревательные столики различных конструкций (В. А. Морозова и др.) или термостаты. Нельзя подогревать предметное стекло на пламени спиртовки или др. методами без контроля температуры. При активности спермиев быка ниже 7 баллов, барана - 8, жеребца - 5 и хряка - 6 баллов сперму не используют для осеменения. Оттаянную сперму в любой расфасовке вынимают из водяной бани и оставляют при т. 18-20°С до использования, но не более 10-15 мин. Вновь замораживать оттаянную сперму нельзя. Подвижность спермиев в оттаянных необлицованных гранулах определяют так же, как в сперме, сохраненной при температуре 2-5°С. Оболочку упаковки доз спермы в облицованных гранулах 2 после оттаивания гранул насухо вытирают марлевой салфеткой, край упаковки зажимают м/у двумя предметными стеклами с помощью специальных пружинных зажимов или бельевых прищепок, ставят на обогревательный столик микроскопа под малое увеличение и просматривают спермии ч/з пленочную упаковку. Допускается использование оттаянной спермы с подвижностью спермиев не ниже 3-4 баллов для коров и телок, 4 баллов для овец и 2 баллов для кобыл. Сохраняемую сперму периодически направляют в лабораторию для бактериологического иссл.
Разбавление спермы. Вся работа по разбавлению спермы должна быть основана на положениях действующих инструкций и других нормативных документов. Разбавлять сперму нужно в течение 30 мин после ее получения и в том случае, если она соответствует требованиям инструкции по показателям подвижности и концентрации спермиев. В состав сред для разбавления спермы входят сахара (лактоза и др.), соли (цитрат натрия и др.), желток куриного яйца, антибактериальные препараты (спермосан-3), а также глицерин, предохраняющий клетки от отрицательного воздействия низких температур. Чтобы предупредить контаминацию микроорганизмами, разбавитель готовят в стерильном боксе. Некоторые компоненты не выдерживают нагревания (желток куриного яйца, глицерин), поэтому стерилизовать их термическими способами нельзя. Компоненты растворяют в прокипяченной дистиллированной воде. Разбавитель хранят при температуре 35 "С не более 3...4 ч. Можно использовать и заранее подготовленную среду, хранящуюся в стерильной упаковке. Выбор разбавителя обусловлен способом хранения спермы. Традиционный способ хранения спермы — ее охлаждение до 2...5°С. В этом случае разбавленную сперму барана сохраняют в течение 24 ч, жеребца — 48 ч и быка — 79 ч после получения. Сперму хряков хранят при температуре 16...20 °С, разбавляя ее средами, содержащими хелатон. Наиболее распространенной является глюкозо-хелато-цитратная среда (ГХЦ), в состав которой входят следующие компоненты: глюкоза — 6 г, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты — 0,37 г, гидрокарбонат натрия — 0,12 г, цитрат натрия — 3,6 г, спермосан-3 — 25...30 тыс. ЕД, вода дистиллированная — 100 мл. После растворения всех компонентов, кроме спермосана, среду стерилизуют на водяной бане в течение 10 мин с момента закипания воды. Затем охлаждают и добавляют спермосан, как описано ранее (приготовление ГЦЖ для разбавления спермы барана).
Сперму собаки хранят в холодильнике до 100 ч, но оптимальным сроком считают 36...48 ч. Для кратковременного хранения сперму разбавляют в соотношении 1: 8 пастеризованным молоком, подогретым до 38...40 "С. Разбавленную сперму разливают в стерильные пробирки по 5... 10 мл, сверху наслаивают стерильный вазелин. Пробирки закрывают пропарафинированными пробками, оборачивают ватой и ставят в холодильник. Сперму быка, предназначенную для хранения в виде необлицованных гранул, разбавляют лактозо-желточно-глицериновой средой, в состав которой входит 11,5 г лактозы, 100 мл дистиллированной воды, 20 мл желтка куриного яйца, 5 мл глицерина, 50 тыс. ЕД. спермосана-3. Простерилизованный раствор лактозы охлаждают до 35...40 °С и добавляют остальные компоненты. Перед замораживанием разбавленную сперму выдерживают в холодильнике при температуре 5 °С З...4ч. В это время, называемое периодом эквилибрации, выравниваются концентрации глицерина в среде и спермиях. Глицерин защищает спермии от действия низких температур только при проникновении внутрь клеток. Сперму быка и барана можно замораживать в виде необлицованных гранул на фторопластовой пластине. Объем лунок должен быть известен заранее, чтобы не измерять его в условиях низких температур. Пластину предварительно стерилизуют методом УФО или спиртовыми тампонами, затем погружают в жидкий азот и выдерживают в нем до прекращения кипения. После этого пластину укрепляют на расстоянии 5... 10 см от поверхности азота (при температуре —160...—170 °С) и в течение 2 мин быстро заполняют лунки спермой из пипетки или шприца (рис. 2.9). Затем пластину вновь погружают в жидкий азот на 1...2мин. После замораживания спермы пластину поднимают из жидкого азота, гранулы спермы собирают в сачок или контейнер, пересыпают в охлажденный контейнер и переносят в сосуды Дьюара с жидким азотом. Чтобы получить облицованные гранулы, сперму быка разбавляют в 2 этапа (средой № 1 и № 2) непосредственно в полиэтиленовом спермоприемнике. Среда № 1: 11%-й раствор лактозы — 63 мл (можно заменить таким же количеством 11%-го раствора сахарозы); желток куриного яйца – 30 мл, глицерин — 7 мл; спермосан-3 — 50... 90тыс.ЕД. Среда № 2: вода дистиллированная — 100 мл; лактоза — 6 г (можно заменить таким же количеством сахарозы); цитрат натрия — 1,4 г; глицерин — 5 мл; спермосан-3 - 50...90 тыс. ЕД.
Спермоприемник соединяют с тонкостенной полимерной трубкой, в которую выдавливают разбавленную сперму. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата ПРЖ на отдельные дозы по 0,25...0,33 мл с герметизацией. Облицованные (герметизированные) гранулы помещают в алюминиевые контейнеры, которые закрывают поролоновыми пробками. Контейнеры закрепляют в обоймах специального устройства, которое помещают в холодильник. После 4...6-часовой экспозиции при температуре 2...5 "С обойму аппарата с контейнерами погружают в жидкий азот на 8... 10 мин и затем переносят в сосуд Дьюара для хранения. В полипропиленовых соломинках (пайеттах) сперму быка замораживают по 0,25 мл. Пайетты заполняют спермой, маркируют, укладывают на штативы и ставят на эквилибрацию на З...4ч при температуре 4 °С, замораживают на металлическом щите, температура которого —120...—130 "С, в течение 5 мин. Сперму жеребцов можно замораживать в виде гранул, однако предпочтительнее замораживать в пакетах по 25 мл при толщине заполненного пакета 4...5 мм. Предварительно охлажденный пакет заполняют спермой. Особое внимание обращают на герметичность. Если она нарушена, при размораживании неизбежны разрывы пакета. Заполненные спермой пакеты маркируют, помещают в держатели поплавка, который опускают к поверхности жидкого азота (рис. 2.10). Выдержав пакеты в парах азота 5...7 мин, переносят в сосуды Дьюара для хранения. Такензи Масатохи и др. разработали разбавитель для хранения спермы собаки в замороженном состоянии: 1 часть 6%-й глюкозы, 3 части сухого молока, 1 часть секайнана-А и 600...900 ЕД/мл пенициллина. Сперму разбавляют в соотношении 1: 4, 1: 8, замораживают в пайеттах, хранят в жидком азоте 2...12 мес. Очень важно определить степень разбавления, то есть соотношение спермы и добавляемой среды. Обычно соотношение выражают двумя цифрами, первая из которых всегда единица, а вторая показывает, сколько миллилитров среды следует добавить к каждому миллилитру эякулята.
Хранение спермы. В настоящее время для длительного хранения спермы применяют замораживание. Только сперму хряков, разбавленную хелатными средами, сохраняют до 3 сут при температуре 16...20°С в термосах-ящиках (рис. 2.11) или бытовых сумках-холодильниках. Сперму баранов, жеребцов и быков хранят при 2...5 °С в холодильниках, пищевых широкогорлых термосах или в специальных термосах, которые загружают тающим льдом. Флаконы, ампулы и др. заворачивают в вату или несколько слоев марли, складывают в полиэтиленовые или резиновые мешочки и размещают в верхней части термоса, обложив по бокам льдом. Если в термосе есть отдельная секция, то, используя ее, необходимо своевременно сливать образующуюся воду и добавлять новые порции тающего льда. Хранение замороженной спермы — очень ответственный этап в технологии искусственного осеменения. Замороженную сперму хранят в канистрах, которые подвешивают к горловине сосуда Дьюара и погружают в жидкий азот (—196 °С). Численность канистр в зависимости от марки сосуда колеблется от трех до шести. Нельзя повторно замораживать сперму. Даже кратковременное повышение температуры до —125 °С, которое происходит при перенесении спермы из одного сосуда Дьюара в другой или при низком уровне жидкого азота в сосуде, приводит к ухудшению качества спермы и даже к гибели клеток. В современных канистрах сосудов Дьюара предусмотрено небольшое боковое отверстие в средней части корпуса, поэтому при подъеме канистра остается до половины заполненной жидким азотом. С учетом указанной особенности спермодозы в канистре не следует располагать выше бокового отверстия, благодаря чему они всегда будут погружены в жидкий азот и, следовательно, не будут нагреваться и портиться. В сосуд Дьюара периодически нужно добавлять жидкий азот, который постоянно испаряется, чтобы не допустить понижения его уровняниже критического. Согласно существующим правилам сосуд Дюара должен быть наполнен жидким азотом не менее чем на 1/3. Однако этому правилу надо следовать с некоторыми поправками. Размеры канистр бываютразные, поэтому боковые отверстия могут располагаться на разном расстоянии от дна сосуда (14....20 см). Уровень жидкого азота в сосуде Дьюара не должен опускаться ниже боковых отверстий, иначе азот не будет затекать внутрь канистры. Доливать жидкий азот в сосуды Дьюара нужно с учетом расположения боковых отверстий на канистрах. Перед заполнением канистры следует измерить расстояние от ее крюка подвешивающего устройства до плоскости, проходящей перпендикулярно корпусу канистры, на уровне бокового отверстия. Чтобы азот затекал в канистру, необходимо, чтобы его уровень располагался выше отверстия не менее чем на 1 см. Контрольное число, показывающее предельно низкий уровень жидкого азота, получают, вычитая единицу (1 см) из измеренного расстояния. Уровень жидкого азота удобно контролировать с помощью длинной линейки (Осташко Ф. И. и др.), при этом измерять следует дважды. Чтобы ускорить работу, можно ограничиться единственным измерением по следующей методике. Линейку нулевым делением вниз опускают плавно через горловину сосуда. При касании конца линейки поверхности жидкого азота последний вскипает и издает характерный шипящий звук; услышав его, линейку перестают опускать, фиксируют расстояние, на которое опустилось ее нулевое деление в сосуд Дьюара. Затем сравнивают полученный результат с контрольным числом. Если измеренное расстояние приближается к контрольному числу, то необходимо добавить жидкий азот.
Дата добавления: 2015-06-26; Просмотров: 1725; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы! Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет |