Изготовление эритроцитарных маркеров

Выделение лимфоцитов на градиенте плотности

Для выделения лимфоцитов из крови крупного рогатого скота используется ряд методов, позволяющих получить относительно чис­тую суспензию лимфоцитов. Наибольшее количество этих клеток вы­деляется при центрифугировании в градиенте плотности урографина или смеси фиколл-урографина плотностью 1,077 г/см3.

Из 76%- или 60%-ного урографина с помощью дистиллированной воды получают 17%-ный раствор, доводя плотность до 1,092 г/см3. В теплой дистиллированной воде готовят 9%-ный раствор фиколла-400 и 34%-ный раствор урографина. Затем смешивают их в соотношении 12:5 соответственно и доводят плотность до 1,077 г/см3.

В пробирки Флоринского с помощью шприца с длинной иглой вносят по 2 мл 17%-ного раствора урографина или смесь фиколлурографина, на который наслаивают по 4 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена, а затем центрифугируют по 20-30 минут при 420 g, если кровь от взрослых животных, или при 600 g, если кровь от молодых животных. После центрифугирования лимфоциты концентрируются в виде матового диска на границе двух жидкостей, а гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки. Образовав­шийся слой лимфоцитов извлекают шприцем с длинной иглой и от­мывают от примесей центрифугированием в пробирках Флоринского по 5 минут при 210 g, используя дважды по 3 мл раствора Версейа, а затем такое же количество раствора Хенкса, в 1 мл которого готовят взвеси выделенных клеток с концентрацией 2-3 тыс./мкл лимфоцитов для последующих постановок реакций розеткообразования. Для под­счета разведения лимфоцитов в 0,38 мл 3%-ной уксусной кислоты вносится 0,02 мл взвеси лимфоцитов. Подсчитывают в камере Горяева в 5 больших квадратах, разделенных на 4, по диагонали. Получен­ную сумму делим на 8. Результат равен количеству мл раствора Хенкса, необходимого для разведения осадка лимфоцитов, чтобы полу­чить концентрацию 2-3 тыс/мкл. Данный коэффициент выведен из расчета, что при концентрации 2-3 тыс/мкл в среднем должно со­держаться 8 клеток в одном большом квадрате.

Эритроцитарные маркеры получают на основе эритроцитов мел­кого и крупного рогатого скота, используя стандартные коммерче­ские компоненты для диагностики туберкулеза животных. Эти ком­поненты соединяют при стандартных условиях приготовления гемо­литической системы и постановки реакции связывания комплемента (РСК), применяющихся в ветеринарных лабораториях.

Маркер для спонтанного розеткообразования. В качестве инди­каторной системы для определения Т-лимфоцитов используют све­жеприготовленную или хранящуюся при температуре +4°С не более суток 0,5%-ную взвесь эритроцитов барана или коз в растворе Хенкса. Перед постановкой реакции эритроциты отмывают физиологиче­ским раствором, осаждая каждый раз центрифугированием при 400 g в течение 10 минут до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет бесцветной (обычно 2-3 раза). Для приготовления 0,5%-ной взвеси 0,05 мл отмытого плотного осадка эритроцитов смешивают с 10 мл раствора Хенкса. Их общепринятая маркировка - Е.

Маркер для комплементарного розеткообразования. В качестве индикаторной системы для определения В-лимфоцитов используют свежеприготовленную или хранящуюся при температуре +4°С не бо­лее трех суток 1%-ную взвесь эритроцитов быка в растворе Хенкса, образовавших иммунные комплексы с гетерофильными антителами и комплементом. После осаждения и трехкратного отмывания центри­фугированием от непрореагировавших компонентов в течение 5 минут при 600 g, используя 30-40-кратные объемы физиологического раствора, их обрабатывают комплементом 30 минут при +37°С и вновь отмывают при аналогичных условиях. Общепринятая марки­ровка-ЕАС.

Приготовление гемолитической сыворотки. Антиэритроцитарную сыворотку получают на 15-й день после восьми внутривенных инъекций 10%-ной суспензии свежих эритроцитов быка на физиоло­гическом растворе, растворе Хенкса или забуференном физиологиче­ском растворе. Эритроциты вводят через 2 дня из расчета 1 мл кле­точной суспензии на 1 кг массы кролика. Антисыворотку инактивируют при 56°С в течение 30 минут, готовят двукратные разведения и ставят реакцию прямой агглютинации с 5%-ной суспензией эритро­цитов быка. Определив субагглютинирующий титр (обычно - 1:100-1:200), сыворотку замораживают.

В качестве комплемента для постановки реакции розеткообразо­вания берут свежую сыворотку белой мыши в оптимальном разведе­нии (1:10).

Маркер для непрямого глобулинового розеткообразования. В ка­честве индикаторной системы для определения лимфоцитов-киллеров используют 1%-ную взвесь в растворе Хенкса эритроцитов быка, об­разовавших иммунные комплексы лишь с гетерофильными антитела­ми гемолитической сыворотки. Для их получения 2,5%-ную взвесь эритроцитов в физиологическом растворе обрабатывают при +37°С в течение 30 минут гетерофильной для них гемолитической сыворот­кой. Затем 3 раза отмывают от непрореагировавших компонентов центрифугированием по 5 минут при 600 g, используя 30-40-кратные объемы физиологического раствора. Сыворотку гемолитическую го­товят на физиологическом растворе и берут в дозе, превышающей ее титр не более чем в 50 раз. Общепринятая маркировка - ЕА.

Маркер для туберкулинового розеткообразования. В качестве индикаторной системы для определения антиген-реактивных лимфо­цитов используют 1%-ную взвесь в растворе Хенкса эритроцитов быка, адсорбировавших ППД-туберкулин. Для их получения 2,5%-ную взвесь эритроцитов в физиологическом растворе обрабатывают в те­чение 2-6 часов при +37°С ППД-туберкулином для млекопитающих. Затем 3 раза отмывают от непрореагировавших компонентов центри­фугированием по 5 минут при 600 g, используя 30-40-кратные объемы физиологического раствора. Туберкулин готовят на физиологиче­ском растворе (берут в концентрации - 1 мг/мл). Общепринятая мар­кировка - ЕТ.

Дата добавления: 2015-07-13