История развития метода культуры растительных тканей

История развития метода культуры клеток, тканей и органов (по Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. СПб.: Изд-во СПбГУ. 2003. 228 с.)

Предысторией развития метода культуры клеток и тканей можно считать период с 1878 по 1902 г. Основоположники этого метода – Х. Фехтинг (1892) и Г. Габерландт (1902) – пытались выращивать кусочки тканей, волоски. Фехтинг (1878) – изучал полярность растений и на основе культивирования in vitro отдельных кусочков растительных тканей показал, что полярностью обладает не только целое растение, но и его отдельные клетки. Рехингер (1893) – пытался определить минимальный объем (количество) клеток, способных к самостоятельному росту на влажном фильтре. Х. Фехтинг (1892) и Г. Габерландт (1902) Длительно растущие культуры Х. Фехтингу и Г. Габерландту получить не удалось, однако им удалось наблюдать процесс образования каллуса у тополя и одуванчика и определить минимальный размер экспланта (фрагмента ткани), способного образовывать каллус. Габерландт (1902) – впервые высказал идею о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений. Полагал, что хлороносные клетки сами способны удовлетворять себя в питательных и других веществах, необходимых для их роста и деления. Основываясь на этой идее он брал слишком специализированные клетки и не смог получить их дедифференцировки (что необходимо для инициации каллусогенеза). Не достигнув экспериментальных успехов, они тем не менее высказали ряд гипотез, в том числе о тотипотентности любой живой клетки растения.

В период с 1902 по 1922 г. основное внимание уделяется разработке оптимальных питательных сред, способных обеспечивать существование и длительное размножение in vitro клеток и тканей растений. Различными исследователями предпринимались попытки культивирования растительных тканей и клеток с применением исскуственных питательных сред (среда Кноппа, Пфейфера), но результат был отрицательным, т.к. во всех работах использовался материал имеющий строгую специализацию, т.е. дифференцированные клетки.

В это время была показана возможность длительного культивирования тканей животных, но с добавлением эмбриональных сывороток и крови. Ботаники также пытались применять экстракты растительных тканей, но успехов не добились. Лишь в 1921 голу Мольяр впервые предложил применить для культивирования растительных клеток меристематическую ткань. В его работах эта ткань росла, но не размножалась, т.к. небыли еще известны принципы составления питательных сред, пригодных для выращивания растительного материала in vitro. В 1922 г. В. Роббинс показал возможность культивирования на синтетической питательной среде меристемя кончика корня томатов и кукурузы. Это было началом применения метода культуры изолированных органов. В 1927 году Чех и Прат выдвинули идею выращивать меристему кончика корня гороха на синтетической питательной среде сложного состава. Но их работы носили эпизодический характер и не дали значительных результатов.

В 1932-1939 гг. начинает работать американский исследователь Ф. Уайт и французский исследователь Р. Готре. Они повторили опыты Роббинса и показали, что изолированные корни с периодическим пересаживанием на свежую среду способны расти неограниченно долго. В начале этими исследователями использовались исключительно меристемы корня, и работы были направлены на выращивание в культуре корней различных растений. Но в 1939 Уайт занялся исследованиями в области культивирования камбиальных клеток с развитием из них каллусной (опухолевой) культуры недифференцированных клеток. Способность к неограниченному росту была продемонстрирована ими для каллусных тканей камбиального происхождения, а также для тканей растительных опухолей.

С 1940 по 1960 г. быстро увеличивается число видов, ткани которых выращивались in vitro. Так, список, приведенный Р. Готре в 1959 г., включает 142 вида. В этот период были получены длительные пересадочные культуры для разных тканей и органов, разработаны составы питательных сред, изучено значение микро- и макросолей для нормального роста. Была выявлена также потребность культур в витаминах и стимуляторах роста, оценено значение натуральных экстрактов – кокосового молока, экстракта каштана – для поддержания роста тканей в культуре, для процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза и в культуре каллусной ткани, и в клеточных суспензиях. Кроме того, был открыт новый класс фитогормонов – цитокининов, показано значение кинетина и зеатина для индукции морфогенеза in vitro. Наконец, были разработан метод выращивания единичных клеток из суспензионной культуры с помощью «ткани – няньки».

В 1960-1975 гг. английский исследователь Е. Кокинг предложил метод получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их ферментами; были найдены условия культивирования протопластов, а с помощью ПЭГа введены в них вирусные РНК, клетки бактерий, органеллы клетки; получены соматические гибриды. В эти же годы был создан метод культуры меристем, позволивший получать безвирусные растения с высоким коэффициентом размножения; продолжалась разработка методов и аппаратуры для культивирования клеток. В 1967 г. впервые были получены растения – регенеранты табака, представляющие сомаклональные варианты исходной формы.

В период с 1976 по 1985 г. разработан метод электрослияния изолированных протопластов (электропорация) и методы селекции гибридных клеток. С использованием изолированных протопластов и векторов, созданных на основе Ti- плазмиды A. tumefaciens, предложен эффективный способ переноса генов для растений. При создании новых форм и сортов сельскохозяйственных растений в этот период применяются методы мутагенеза и клеточной селекции, получение сомаклональных вариантов и экспериментальных гаплоидов. В итоге рождается новая наука – генетика соматических клеток высших растений.

В нашей стране до 1957 года работы с культурой тканей растений были очень малочисленны. Основная их часть была направлена на исследование поведения в культуре in vitro изолированных зародышей или корней. Так культурой корней занимался Прокофьев (1944). Метод культуры изолированных зародышей был использован для выращивания гибридных форм растений (Ивановская 1946, 1960 – работала с пшенично-элимусными гибридами, Здруйковская 1951-1961 – занималась выведением раннеспелых сортов персика и черешни).

Далее культурой растительных тканей стали серьезно заниматься в нескольких научных центрах. Основным из них являлась группа ИФР имени Тимерязева, сформированная в 1957. Работа этой группой велась по нескольким направлениям:

1. Культура изолированных корней (Смирнов)
2. Культура изолированных верхушек почек растений (Бутенко, Чайлахян)
3. Длительное пассирование каллусных и суспензионных культур (корня жень-шеня, стеблей дихроа противолихорадочной, барвинка розового и др).

Большое развитие позже получили методы оргеногенеза, изучения дифференцировки и дедифференцировки клеток (Бутенко, Яковлева), культуры изолированных тканей древесных и кустарниковых (Быченкова).

Использование культуры растительных клеток высших растений.

Культуру клеток высших растений можно рассматривать в нескольких аспектах.

1. Как биологическую систему.
2. Как модель для физиологических исследований.
3. Как инструмент для решения фундаментальных и прикладных целей.

Первый аспект предполагает оценку культуры клеток, как экспериментально созданной популяции соматических клеток. Ее характеристиками являются:

а) отсутствие организменного контроля развития,

б) избыточный генетический материал.

Изучаемые вопросы в этом направлении могут звучать следующим образом:

а) Изучение поведения клеток при переходе в условия популяционного развития, что включает изменение морфологические, биохимические и генотипические.

б) Анализ гетерогенности системы в результате целенаправленных изменений условий культивирования (перспективно выращивание в хемостатах)

в) Изучение поведения избыточного генетического материала в культивируемых клетках (влияние его на развитие популяции, изменение в процессе культивирования, возможность перехода системы к альтернативному пути развития – приобретение автотрофности).

Второй аспект заключается в том, что культура клеток может служить хорошей моделью для различного рода исследований, но степень ее адекватности зависит от исследуемого процесса. Оценить эту степень адекватности можно, опираясь на свойства культуры клеток как биологической системы:

а) она адекватна для процессов, протекающих в любой растительной клетке, не зависимо от механизмов их контроля.

б) она не адекватна в случаях, где ведущую роль имеют организменные факторы, вплоть до альтернативной. Но в ряде случаев использование такой модели может быть более информативно, чем адекватно.

Области возможного применения культуры клеток растений как модельной системы:

а) Изучение роста и развития – система неадекватна, т.к. рост и развитие интактного растения находится под строгим организменным контролем. Но модель позволяет изучать онтогенез отдельных клеток в «чистом виде».

б) Изучение вторичного метаболизма – модель неадекватна, т.к. основной функцией вторичного метаболизма в растении является решение экологических проблем растения в целом. Следовательно, синтезы вторичных метаболитов находятся под жестким организменным контролем. С другой стороны изучение этих процессов информативно с практической точки зрения (вторичный метаболизм в культуре может понижаться или исчезать, но восстанавливаться при появлении морфогенных структур).

в) Изучение механизмов устойчивости и адаптации – модель адекватна для клеточного уровня, но неадекватна, если устойчивость определяется на уровне целого организма. В данном случае система позволяет различить эти уровни. При этом, достаточно часто механизмы устойчивости, работающие на уровне отдельных клеток, не проявляются на уровне целого растения. С другой стороны работа по этому направлению позволяет проводить селекцию тканей, а далее и целых растений-регенерантов, с повышенной устойчивостью к тем или иным факторам среды.

г) Изучение процессов эмбрио- и морфогенеза – система очень адекватна, т.к. регуляция идет на уровне самой системы. Доказательствами адекватности может послужить идентичность конечного морфогенетического результата в системе in vitro и in vivo, а так же аналогичность последовательности процессов. Но имеются и отличия: это отсутствие строгой упорядочности на первых этапах развития и изменчивость инициальных клеток (сомаклональная изменчивость), что не типично для системы целого растения.

Работа по этому направлению позволяет исследовать многие процессы, изучение которых на зиготических эмбрионах практически невозможно (роль генотипа в процессе соматического биогенеза, роль ядерной и митохондриальной ДНК в способности к такому эмбриогенезу, роль различных факторов внешней среды на развитие эмбриоидов).

Третий аспект предполагает следующие направления исследований.

Ценность культуры в экологическом плане, т.к. культура клеток растений является эффективным средством сохранения генофонда вида или сохранения уникальных штаммов, генотипов – продуцентов (методы – сохранение в виде поддержания культур или их криосохранение, сохранение отдельных генотипов в виде меристем (массы недифференцированных клеток не позволяя им пролиферировать), сохраение генофонда исчезающих видов в виде эмбриогенных культур).

Ценность культуры клеток растений для растениеводства реализуется:

а) методом микроклонального размножения отдельных видов, особенно тех, которые не поддаются размножению черенкованием и привоем, а семенное потомство нежизнеспособно; (получение микроклубней картофеля в биореакторах)

б) клеточной селекцией на основе методов изучения устойчивости и адаптации;

в) на уровне получения искусственных семян с использованием метода соматического эмбриогенеза (капсулы альгинатного геля – жизнеспособность до 80%);

г) методы генетической инженерии (агробактериальныя трансформация, слияние протопластов, электропорация, биобалистика)

Одно из направлений использования культуры клеток растений является промышленная биотехнология. Основана она на использовании методов получения вторичных метаболитов. Она позволяет получать различные вещества для пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. В данном случае перспективно использование биореакторов.

Дата добавления: 2013-12-13