Л и т е р а т у р а

Проведение ТСХ-скрининга. (занятие № 14) 1. Актуальность: Точное установление вида токсического вещества, выделяемого из биологического материала из-за малой специфичности общепринятых методов диагностики невозможно без применения хроматографического скрининга в тонком слое сорбента. Метод позволяет с наименьшими затратами средств и времени определить групповую принадлежность предполагаемых ядов, таким образом сужая круг поиска токсических веществ. 2. Учебные цели: В результате усвоения темы студент должен уметь: -проводить предварительные методы исследования органических веществ: ТСХ-анализ в общей и частной системах растворителей; - давать химико-токсикологическую оценку результатам анализа. Для формирования умений студент должен знать: - методы очистки, разделения и концентрирования органических веществ; -теоретические основы хроматографического анализа в тонком слое сорбента; - принципы работы физико-химических методов исследования. 3. Материалы для самоподготовки к усвоению данной темы Вопросы для самоподготовки к занятию 1. Общая характеристика современных предварительных методов анализа лекарственных соединений и наркотических веществ (ТСХ, ВЭТСХ, ВЖХ–анализ, ГЖХ–анализ, иммунохимические методы, экспресс-тесты). Пределы обнаружения, специфичность. Возможности использования в химико-токсикологическом анализе. Значение в программе комплексного использования методов. 2. Тонкослойная хроматография: материалы, методика. Оценка результатов исследования. 3. Данные судебно-медицинской диагностики отравлений и направленность химико-токсикологического анализа. Выбор метода исследования. 4. Направленный химико-токсикологический анализ. 5. Основы построения ненаправленного химико-токсикологического анализа. Аналитический скрининг. 4. Вид занятия: практическое занятие. 5. Продолжительность занятий: 4 часа 6.Оснащение: таблицы, атласы. 7. Содержание занятия. 7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений. Задания и вопросы для самоконтроля

Дополнительная 1. Журнал Судебно-медицинская экспертиза № 4 (1967), 5 (1981), 6 (1978). 2. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия, М., 1975. с. 376. 3. “Группа веществ, изолируемых экстракцией полярными растворителями”. Учебно-методическая разработка для самоподготовки выполнения лабораторных работ студентов по токсикологической химии. Изотов Б.Н., Волкова И. В., Зинакова Е. Д. -М. - I ММА имени И. М. Сеченова, 1987. 4. Белова А.В. Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии, М., “Медицина”, 1976, 231 с. 180. Вопросы для самоподготовки к очередному занятию: 1.Подтверждающие методы анализа: химические и физико-химические (теоретическая основа, приборы, материалы, методика). 2. Общие и частные реакции обнаружения лекарственных веществ и наркотических средств кислотного и нейтрального характера: ноксирон, гексенал, этаминал натрия, бутабарбитал, бензонал, барбамил, барбитал, фенобарбитал, салициловая кислота, теобромин, теофиллин, кофеин, наркотин, амидопирин, антипирин, меконин, меконовая кислота, фенацетин. 3. Физико-химический анализ: УФ-спектрофотометрия, ИК-спектроскопия, флюориметрия, масс-спектрометрия, ВЭЖХ-, ГЖХ-анализ органических лекарственных веществ кислотного и нейтрального характера. 4. Интерпретация результатов химических реакций и физико-химических методов анализа: методы и реакции, имеющие «положительное», «отрицательное», «в совокупности», «ориентирующее» химико-токсикологическое значение.

1. Какие этапы включает в себя предварительное исследование? В чем цель предварительного исследования? 2. Какие химические реакции используют для предварительного обнаружения производных барбитуровой кислоты, пиразолона, фенотиазина? 3. Укажите особенности оформления пластинки в ТСХ-скрининге лекарственных и наркотических веществ? 4. Объясните цель нанесения на пластинку двух стандартов и двух порций экстрактов в соответствущие зоны пластинки? 5. Какие стандарты-метчики используются при хроматографическом скрининге экстракта из кислой среды, из щелочной среды? 6. Укажите состав подвижных фаз, используемых в ТСХ-скрининге. 7 Какие реактивы и в какой последовательности применяют для обнаружения средств кислотного характера обнаружения средств основного характера? 8. Что представляет собой реактив Драгендорфа? В чем суть и цель модификации реактива Драгендорфа? 9. Объясните термин «аналитический скрининг». 10. Какие требования предъявляются к скрининговым методам? Тестовые задания 1. В основу процесса жидкостной экстракции положена теория: а) химического равновесия; б) растворов; в) межфазового равновесия. 2. На каком законе основанного разделение смесей методом дистилляции? А. Законе Генри Pb=Kb · b Б. Законе Рауля Ra=Mа · Pa^o 7.2. Разбор преподавателем узловых вопросов, необходимых для усвоения темы. Построение направленного и ненаправленного хроматографического скрининга. Интерпретация результатов ТСХ-скрининга. 7.3. Демонстрация преподавателем практических приемов. Показательная демонстрация обработки хроматографических пластинок реактивами и измерения оптической плотности органического лекарственного препарата. 7.4. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя: лабораторная работа 7.4.1. Оснащение учебной лаборатории 7.4.1.1. Реактивы, системы для хроматографирования: ацетон, хлороформ-ацетон (9:1), реактив Драгендорфа, раствор хлорида железа (III), йод кристаллический, 2 % спиртовый раствор п-диметиламинобензальдегида в серной кислоте (1:1).

амидопирин:

1. оранжевая А. натрия нитрит + НСIО₄ 2. бурая Б. хлорид окисного железа 3. зелено-голубая В. реактив Драгендорфа 4. сине-фиолетовая Г. реактив Драгендорфа модифицированный по Мунье 5. розовая Д. с нитратом серебра Типовые ситуационные задачи по определению уровня усвоения темы занятия и их решения Ситуационная задача. В судебно-химическом отделении СМЭ доставили труп девочки с подозрением на отравление психотропными веществами (аминазин). В больнице принимала фенацетин и аспирин. Как провести предварительный анализ (ТСХ-скрикинг) экстрактов их трупного материала? Привести схему судебно-химического исследования. Решение: Необходимо взять две хроматографические пластинки. На одну из них поочередно в три точки по линии страта наносят «кислый» экстракт. Аналогично на вторую наносят «щелочной» экстракт. Пластинку с «кислым» извлечением хроматографируют в системе хлороформ-ацетон, со «щелочным» - ацетон-хлороформ-диоксан-аммиак. После развития хроматограммы и высушивания «кислую» пластинку обрабатывают поочередно, закрыв 2/3 пластинки сульфатом ртути и дифенилкарбазоном, вторую полоску – хлоридом окисного железа (III), третью – реактивом Драгендорфа. Пластинку со «щелочным» извлечением сначала рассматривают при УФ-свете, затем обрабатывают реактивом Драгендорфа. После чего рассчитывают значение Rf и сопоставляют с Rf стандартных веществ (метчиков). Л И Т Е Р А Т У Р А Основная 1. Плетенева Т. В. Токсикологическая химия, Москва, «ГЭОТАР-Медиа», -2005 с. 509. 2. Крамаренко В. Ф. Токсикологическая химия. Киев, “Вища школа”, -1989, с. 447. 3. Анализ наркотических средств. Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств, под ред. Изотова Б.Н., Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В.“Мир”, -1993, с. 260. 4. Лекционный материал.

7.4.1.2. Приборы и оборудование: капилляры,пульверизатор, спринцовки, камеры хроматографические, сушильный шкаф, УФ-облучатель. 7.4.1.3. ТСХ-анализ экстрактов Хлороформ после экстракции токсических веществ, исследуют на наличие неизвестных ядов методом ТСХ. Берут две хроматографические пластинки “Силуфол” или хроматографическую бумагу (размером 4 х 10), (вещества основного характера желательно наносить на пластинку забуференную 0,025 н раствором гидроксида натрия). “Кислое” и “щелочное” извлечения наносят на линию старта, на разные пластинки тонким стеклянным капилляром многократно (примерно 10-15 касаний). Во вторую и третью точку наносят спиртовые растворы метчиков, указанные преподавателем. Пластинки с “кислым” извлечением хроматографируют в системе хлороформ-ацетон (9:1), а со “щелочным” извлечением в системе ацетон. После развития хроматограммы пластины извлекают из камер, растворитель испаряют при комнатной температуре. 7.4.1.4. Исследование хроматограмм с “кислым” извлечением. Хроматограммы с “кислым” извлечением обрабатывают реактивами в следующей последовательности: а) две трети пластины закрывают стеклянной пластиной или бумагой, а одну треть (первую зону), соответствующую первому пятну, опрыскивают 2% раствором п-диметиламинобензальдегида в смеси серной кислоты и 95% спирта этилового. Этим реактивом проявляются сульфаниламиды в виде желто-оранжевых, а производные барбитуровой кислоты в виде сине-фиолетовых и красно-фиолетовых пятен. б) эту же зону после испарения (или вторую зону) обрабатывают 5 % раствором хлорида железа (III). Проявляются: салицилаты - фиолетовое, производные пиразолона (анальгин, антипирин) - оранжевое или оранжево-красное; в) третью зону обрабатывают реактивом Драгендорфа или Драгендорфа, модифицированным по Мунье (алкалоиды слабоосновного характера: кофеин, теофиллин, производные 1.4-бенздиазепина – диазепам, нитразепам), или помещают в камеру с парами йода. 7.4.1.5. Исследование хроматограмм “щелочного” извлечения. а) рассматривают в УФ-свете, отмечают флюоресценцию: раствор хинина, подкисленный серной кислотой имеет голубую флюоресценцию,в щелочной среде – фиолетовую, продукты окисления – желто-зеленую; резерпин в присутствии 1% раствора уксусной кислоты имеет желто-зеленую флюоресценцию. б) обрабатывают реактивом Драгендорфа или парами йода: практически все вещества основного характера имеют оранжево-коричневое окрашивание при обработке реактивом Драгендорфа и желто-синие пятна при обработке парами йода. Результаты проведенных исследований “кислого” и “щелочного” извлечений заносят в рабочую тетрадь в виде таблицы.

2. бурая Б. хлорид окисного железа 3. зелено-голубая В. реактив Драгендорфа 4. сине-фиолетовая Г. реактив Драгендорфа модифицированный по Мунье 5. розовая Д. с нитратом серебра

Все нижеперечисленное,касающееся методов очистки алкалоидов верно, кроме:

А. экстракционный Б. тонкослойная хроматография В. электрофорез Г. диализ Д. сублимация Е. микроперегонка

В тонкослойной хроматографии скорость перемещения элюента зависит от:

А. объема камеры Б. природы сорбента В. толщины слоя сорбента Г. способа приготовления слоя сорбента Д. температуры окружающей среды Е. предварительного насыщения камеры

Обычно в ТСХ пробы наносят на пластинку отступив от края не менее:

А. 5 мм Б. 10 мм В. 20 мм Г. 25 мм, а расстояние между соседними пятнами должно составлять не менее: А. 30 мм Б. 20 мм В. 15 мм Г. 5 мм

Для проявления зон в ТСХ используют:

А. спектрофотометрию Б. флюоресценцию В. обугливание Г. рефрактометрию Д. обработку реактивами Подберите соответствующие пары: окраска хроматографического пятна – используемый реактив на

Данные хроматографического скрининга веществ кислого, нейтрального и основного характера система растворителей: (указать используемую систему растворителей).

№ п/п	Токсическое вещество	Значение Rf	Окраска пятен
Хлорное железо 5 %	Спирт. р-р п-ДМБА в серной кислоте	реактив Драгендорфа или пары йода

Значение Rf токсических веществ в системе хлороформ – ацетон (9: 1),

№ п/п	Название	Проявитель	Окраска пятен	Значение Rf в системе хлороформ – ацетон (9: 1)
1.	Стрептоцид	Спирт. р-р п-ДМБА в серной кислоте	желтая	0,42-0,47
2.	Анальгин	Реактив Драгенд.	оранжево-коричневое	0,3-0,33
3.	Фенацетин	¾-“¾-“¾-	красно-фиолетовая	0,37-0,45
4.	Салициловая кислота	5% FeCl₃	фиолетовая	0,17-0,21
5.	Антипирин	5% FeCl₃	красно-оранжевая	0,20
7.	Кофеин	Реактив Драгенд.	серо-коричневая	0,56

Значение Rf токсических веществ в системе ацетон

№ п/п	Название	Проявитель	Окраска пятен
1.	Хинин	Реактив Драгенд.	оранжево-коричневая
2.	Антипирин	Реактив Драгенд.	оранжево-коричневая
3.	Новокаин	Реактив Драгенд.	оранжево-коричневая
4.	Папаверин	Реактив Драгенд.	желто-оранжевая
5.	Аминазин	Реактив Драгенд. раствор HNO₃ в этаноле 1:9.	оранжево-коричневое розово-фиолетовая	0,75

В качестве неподвижных фаз в тонкослойной хроматографии используют:

А. уголь активированный Б. силикагель В. глинозем Г. целлюлоза Д. ионообменные смолы

Объем пробы, наносимой на хроматографическую пластину может изменятся от …до…:

А. 20 - 40 мкл Б. 1 – 10 мкл В. 100 – 200 мкл Г. 1000 – 5000 мкл

При анализе разбавленных растворов, на хроматорафическую пластинку наносят пробу:

А. одну каплю Б. последовательно несколько капель после высушивания предыдущей В. последовательно несколько капель не подвергая высушиванию предыдущей

Для каждой фазы выберите правильный ответ:

А. если фраза связана только с i Б. если фраза связана только с F В. если фраза связана только с g Г. если фраза связана и с i, и с F, и с g Д. если фраза не связана не с i, не с F, не с g Е. если фраза связана только с i и с F Ж. если фраза связана только с F и с g I. Перед идентификацией наркотина его отделяют от морфина i – методом тонкослойной хроматографии F – растворением смеси в щелочах с последующим отделением наркотина g – экстракцией хлороформом II. Исследование на наличие наркотина производят в тех случаях, если i – есть указания органов дознания F – в вытяжках из биологического материала обнаружен морфин g – при действии восстановителей превратился в меконин

Подберите соответствующие пары: окраска хроматографического пятна – используемый реактив на нитразепам:

1. оранжево-желтая А. натрия нитрит + НСIО₄

7.5. Контроль усвоения темы занятия - материала для контроля уровня усвоения темы (тесты, ситуационные задачи. Весь набор контролирующих тестов и задач по теме предлагаются студентам во время практического занятия, правильность решения контролируется преподавателем). Тесты 1. Тонкослойная хроматография является методом, в котором подвижная фаза перемещается за счет: А. осмоса Б. капиллярного действия В. ионообменных реакций Г. летучих свойств веществ 2. Тонкослойная хроматография имеет предпочтение как аналитический метод из-за: А. простоты Б. надежности В. высокой стоимости Г. сложности методик Д. требует термической стабильности анализируемых веществ Е. требует летучести анализируемых веществ 3. Органические вещества перемещаются по хроматографической пластине с различной скоростью, которая зависит от: А. летучести веществ Б. растворимости веществ В. величины рКа веществ Г. величины коэффициента распределения 4. Установите соответствие: все вещества основного характера можно разделить, исходя из значения Rf, на четыре хроматографические зоны: 1. I - зона (Rf0,12-0,36) А. антипирин 2. II – зона (Rf0,5-0,58) Б. хлордиазепоксид 3. III – зона (Rf0,63-0,83) В. кокаин 4. IV – зона (Rf0,87-0,98) Г. атропин Д. эфедрин Е. кодеин З. нитразепам И. кофеин К. морфин М. аминазин Л. хинин Н. амидопирин

исследования сначала:

А. хроматографируют метчики раздельно в выбранной системе растворителей Б. хроматографируют смесь метчиков в выбранной системе растворителей В. хроматографируют метчики в стандартной системе растворителей Г. значения Rf сравнивают с табличными данными

Для каждой фазы выберите правильный ответ:

А. если фраза связана только с К Б. если фраза связана только с М В. если фраза связана только с Н Г. если фраза связана и с К, и с М, и с Н Д. если фраза не связана не с К, не с М, не с Н Е. если фраза связана только с К и с М 1. если неподвижная фаза К. – система называется более полярна, чем неподвижная нормальной фазовой системой 2. если неподвижная фаза М. – систему называют менее полярна, чем подвижная обращенно-фазной Н. – систему называют универсальной

Установите соответствие: вес вещества основного характера можно разделить, исходя из значения Rf, на четыре хроматографические зоны:

1. I - зона (Rf0,12-0,36) А. антипирин 2. II – зона (Rf0,5-0,58) Б. хлордиазепоксид 3. III – зона (Rf0,63-0,83) В. кокаин 4. IV – зона (Rf0,87-0,98) Г. атропин Д. эфедрин Е. кодеин З. нитразепам И. кофеин К. морфин М. аминазин Л. хинин Н. амидопирин

Силикагель является наиболее распространенным адсорбентом, представляет собой гидратированную кремневую кислоту, являясь:

А. слабоосновным по природе Б. слабокислым по природе В. амфотерным

5. ТСХ в химико-токсикологическом анализе применяется с целью: А. разделения веществ Б. очистки веществ В. идентификации веществ Г. концентрирования Д. экстракции веществ Ж. количественного определения 6. В тонкослойной хроматографии скорость перемещения веществ возрастает с: А. уменьшением толщины слоя сорбента Б. увеличением концентрации веществ В. уменьшением объема камеры Г. увеличение полярности элюента Д. уменьшением длины пластинки 7. Нижний конец хроматографической пластинки погружают в элюент не более чем на: А. 10 мм Б. 20 мм В. 5 мм Г. 1 мм 8. Все нижеперечисленное, касающееся методов очистки алкалоидов верно, кроме: А. экстракционный Б. тонкослойная хроматография В. электрофорез Г. диализ Д. сублимация Е. микроперегонка 9. Подберите соответствующие пары: окраска хроматографического пятна – используемый реактив на хинин: 1. Оранжево-коричневая А. натрия нитрит + НСIО₄ 2. бурая Б. хлорид окисного железа 3. зелено-голубая В. реактив Драгендорфа 4. сине-фиолетовая Г. реактив Драгендорфа модифицированный по Мунье 5. розовая Д. с нитратом серебра Е. УФ-облучение 10. Метод двумерного хроматографического разделения в ТСХ основан на: А. ступенчатом элюировании двумя или несколькими растворителями Б. непрерывном градиентом состава растворителей

В. разделении определенным элюентом в одном направлении, затем под углом 90⁰ элентом другой полярности Г. разделении определенным элюентом в одном направлении, затем элюируют в противоположную сторону (под углом 180⁰) тем же растворителем 11. Верно ли определение? «Скрининг» – (screening – англ.: сито, просеивать) – возможность проанализировать очень малые количества веществ с почти одинаковыми хроматографическими свойствами.

Во время хроматографирования запрещено:

А. камеру держать закрытой Б. держать камеру рядом с нагревательным прибором В. насыщать камеру Г. на дно камеры наливать растворитель или смесь

Чистоту растворителей для хроматографирования проверяют:

А. химическим способом Б. хроматографическим В. спектрофотометрическим Г. иммуноферментным

При отсутствии стандартов метчики - «свидетели» можно приготовить из соответствующих лекарственных препаратов, но при этом может наблюдаться:

А. не полное проявление метчиков Б. не полное совпадение Rf метчика и анализируемого вещества В. отсутствие разделения смесей токсических веществ Г. полное совпадение Rf метчика и анализируемого вещества

Подберите соответственно: окраска хроматографического пятна – анализируемый реактив на кофеин:

1. Оранж.-коричн. А. хлорид окисного железа 2. Оранжевая Б. реактив Драгендорфа 3. Сине-фиолетовая В. сульфат ртути с дифенилкарбазидом 4. Красно-оранжевая

ТСХ- скрининг преимущественно используют при анализе:

А. однокомпонентных смесей Б. многокомпонентных смесей В. при направленном анализе Г. при ненаправленном анализе

Установите соответствие: обнаружение соединений на хроматограмме осуществляют:

А. веществ неполярных Б. неорганических соединений В. большинства органических веществ Г. фенольных веществ

Определяемые вещества образуют окрашенные соединения с реагентом за счет:

А. взаимодействия с одной функциональной группой Б. взаимодействия с несколькими функциональными группами Г. взаимодействия со всей молекулой Д. взаимодействия непосредственно с сорбентом

Верно ли определение?

Тонкослойная хроматография является методом, в котором подвижная фаза перемещается за счет капиллярного действия через равномерный тонкий слой точно разделенной неподвижной фазы.

Верно ли утверждение: неподвижная фаза – тонкий слой сорбента соединен с пластиной, изготовленной из стекла, алюминия или полиэтилентерефталата.

Установите соответствие: хроматографическая зона в зависимости от значения Rf – токсическое вещество, имеющее значение Rf в данном интервале:

1. I - зона (Rf 0 -0,25) А. барбитал 2. II – зона (Rf 0,31-0,40) Б. антипирин 3. III – зона (Rf 0,41-0,64) В. диазепам Г. циклобарбитал Д. амидопирин Е. кофеин Ж. Этаминал натрия

На воспроизводимость величины Rf не влияют факторы:

А. соотношение сорбента и связующего вещества Б. присутствие примесей В. равномерность толщины слоя сорбента Г. температура Д. не удаленный полностью растворитель нанесенной пробы на пластинку

Силикагель можно использовать для разделения:

А. веществ неполярных Б. неорганических соединений В. большинства органических Г. фенольных веществ Для получения надежных результатов хроматографического

1. 5% р-р НgSO₄ в конц.H₂SO₄ А. антипирин и 0,1% р-р дифенилкарбазида Б. бутобарбитал в хлороформе В. циклобарбитал 2. 10% р-р FeCI₃ Г. амидопирин 3. модифицированный Д. салициловая кислота реактив Драгендорфа Е. элениум Ж. фенобарбитал З. нитразепам

Для каких веществ можно использовать ТСХ-анализ для предварительного установления их в объекте:

1. аминазина 6. барбамила 2. хлордиазепоксида 7. бария сульфат 3. ртути хлорид 8. оксазепама 4. кокаина 9. меркургексана 5. промедола 10. феназепама

Хроматографические пластинки с целью проявления веществ облучают Уф - лампой с длиной волны:

А. 154 нм Б. 254 нм В. 350 нм Г. 650 нм

Совпадение Rf неизвестного соединения и метчика позволяет сделать заключение о химической природе вещества:

А. окончательно Б. предварительно В. достаточно для заключения эксперта

Верно ли определение?

Тонкослойная хроматография является методом, в котором подвижная фаза перемещается за счет капиллярного действия через равномерный тонкий слой.

Верно ли утверждение: неподвижная фаза – тонкий слой сорбента соединен с пластиной, изготовленной из стекла, алюминия или полиэтилентерефталата.

Установите соответствие: хроматографическая зона в зависимости от значения Rf – токсическое вещество, имеющее значение Rf в данном интервале:

1. I - зона (Rf 0 -0,25) А. барбитал 2. II – зона (Rf 0,31-0,40) Б. антипирин 3. III – зона (Rf 0,41-0,64) В. диазепам Г. циклобарбитал Д. амидопирин

Е. кофеин Ж. этаминал натрия

Обычно для сцепления неподвижной фазы с пластинкой хроматографической используют:

А. сульфат магния Б. метилцеллюлозу В. крахмал Г. сульфат кальция

В качестве неподвижных фаз в сорбционных методах анализа используют все нижеперечисленные, за исключением:

А. силикагель Б. глинозем В. кизельгур Г. силикат магния Д. ионообменные смолы (полисорб) Е. тальк

Косвенное проявление веществ на хроматографических пластинках УФ-светом предполагает:

А. введение флюоресцирующих веществ в состав системы растворителей Б. введение флюоресцирующих веществ в состав сорбента В. элюирование токсических веществ флюоресцирующими веществами Г. непосредственное свечение флюорогенов

В ТСХ величину Rf определяют как:

А. отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному растворителем Б. отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному стандартным веществом Г. отношение расстояния, пройденного веществом, к длине пластины Д. отношение расстояния, пройденного растворителем, к длине пластины

На воспроизводимость величины Rf влияют факторы:

А. соотношение сорбента и связующего вещества Б. присутствие примесей в сорбенте В. равномерность толщины слоя сорбента Г. температура Д. не удаленный полностью растворитель нанесенной пробы на пластинку

Силикагель можно использовать для разделения: