Культивирование

Условия проведения ферментаций

Для обеспечения проведения процесса ферментации необходимо строгое соблюдение таких условий, как качество питательной среды (состав), температура, аэрация, давление, перемешивание, рН среды, количество исходных клеток, свет.

Основные показатели, характеризующие ферментационный процесс:

1. Физические показатели: температура, давление, вводимая мощность, частота вращения мешалки, пенообразование, скорость потока воздуха (инертного газа), скорость потока питательной среды, вязкость, турбулентность, мутность и др.

2. Химические показатели: рН среды, окислительно-восстановительный потенциал, содержание растворимого О₂ и СО₂, содержание О₂ и СО₂ в подаваемом газе (воздухе), содержание углерода, содержание предшественников роста, содержание азота, фосфора, Мg⁺², К⁺, Са⁺², Nа⁺, Fе⁺², SО₄ ^-2 и др., концентрация синтезируемого продукта.

3. Биологические показатели: содержание субстрата, продукта, отсутствие посторонней микрофлоры.

4. Физическое состояние продуцента: удельная скорость роста, его морфологическое состояние (величина клетки, количество делящихся клеток), ряд биохимических показателей (содержание РНК, ДНК, NАD, NАDН₂, АТР, АМР, активность ключевых ферментов.

Автоматизация процесса контроля за ферментацией (за перечисленными показателями), позволяет не только регистрировать анализируемые показатели, но и регулировать их.

Стадия культивирования микроорганизмов является наиболее сложной и ответственной.

Рост и культивирование биомассы требуют следующих условий:

· жизнеспособности посевного материала;

· наличия источника энергии (тепла);

· достаточного количества соответствующей питательной среды;

· необходимых физико-химических условий для жизнедеятельности.

С начала 1950-х гг. вирус полиомиелита для производства вакцины выращивали в культуре клеток млекопитающих, в том числе фибробластов эмбриона человека. С тех пор фибробласты эмбриона стали незаменимы для выделения и выращивания ряда других вирусов, при производстве высокоспецифичных белков (антителе, интерферонов), в исследованиях рака и противовирусной химиотерапии.

Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма (эмбриональных или тканей новорожденных), называют первичными культурами. В большинстве случаев клетки первичной культуры переносят из культуральной чашки и используют для получения большого количества вторичных культур, которые можно последовательно перевивать в течение недель или месяцев. Разные типы клеток нуждаются в различных питательных веществах, а также в одном или нескольких белковых факторах роста.

Клеточные линии можно использовать для получения клонов, которые происходят из одной клетки-предшественника.

Биотехнология использует методы поверхностного и глубинного культивирования микроорганизмов.

При поверхностном культивировании (в монослое) суспензию клеток получают обработкой измельчённой ткани эмбриона трипсином. Клетки в такой суспензии, оседая на плотной поверхности сосуда с культуральной средой, становятся плоскими и делятся, образуя монослой на поверхности сосуда. Обычно при этом способе культивирования пользуются цилиндрическими бутылями, которые медленно вращаются вдоль своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель - микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются и пролиферируют. Суспензионные культуры можно получать в сосудах объёмом до 1000 л при перемешивании.

Преобладающим является глубинный метод культивирования, предполагающий возможность использования всего объема питательной среды.

На рост и развитие микроорганизмов влияют внутри- и внеклеточные факторы. К внутриклеточным факторам относятся: структура клетки, механизмы метаболизма и генетические характеристики. Внеклеточные (внешние) факторы, т.е. условия внешней среды клетки, являются основными регуляторными факторами биотехнологии.

Микроорганизмы можно выращивать:

· в ферментере периодического действия;

· в ферментере периодического действия с добавлением субстрата;

· в непрерывной культуре.

В первом случае микроорганизмы выращивают в стерильных условиях без добавления в ходе ферментации свежей культуральной среды. При периодической ферментации свежей культуральной среды, концентрация микроорганизмов (биомассы), количество белкового продукта или метаболита зависят от фазы роста, клеточного метаболизма и наличия питательных веществ.

Как было сказано ранее (в лекции № 7-8), различают шесть основных фаз роста:

- лаг-фаза (1);

- фаза ускорения (2);

- экспоненциальная или логаримическая фаза (3);

- фаза замедления (4);

- стационарная фаза (5);

- фаза отмирная (6).

Как правило, после инокуляции стерильной культуральной среды мгновенного увеличения числа клеток не наблюдается.В течение определенного увеличения числа клеток не наблюдается. В течение определенного периода времени, называемого лаг-фазой, клетки адаптируются к новым условиям (другим рН или концентрации питательных веществ). Продолжительность лаг-фазы зависит от времени, в течение которого клетки посевного материала находились в стационарной фазе, и от того, насколько различалась среда, в которой росла культура, от новой, свежей культуральной среды.Если посевным материалом служит культура, находящаяся в экспоненциальной фазе, выраженная лаг-фаза может отсутствовать и рост клеток начнется немедленно после инокуляции. Между лаг- и экспоненциальной фазами есть короткий период- фаза ускорения, когда скорость роста клеток увеличивается до достижения постоянной величины. В период экспоненциальной фазы клетки претерпивают несколько делений. Когда субстрат присутствует в избытке, достигается максимальная скорость роста культуры в экспоненциальной фазе, из-за большого числа клеток в конце экспоненциальной фазы субстрат расходуется очень быстра, наступает фаза замедления, которая может быть кратковременной. В результате истощения лимитирующего субстрата или накопления продуктов метаболизма, замедляющих рост, увеличение числа клеток постепенно прекращается и кульуте переходит в стационарную фазу. В это время биомасса остается постоянной, метаболизм претерпевает кардинальные изменения, синтезируются соединения (вторичные метаболиты), представляющие коммерческий интерес, например антибиотики. Продолжительность стационарной фазы зависит от конкретнного микроорганизма условий роста. В фазе отмирания метоболизм прекращается, так как энергетические запасы клеток оказываются исчерпанными. При промышленном синтезе, еще до наступления фазы отмирания, ферментацию остановливают.

Периодическая культура с добавлением субстрата предполагает периодическое внесение в ферментер увеличивающегося количества питательных веществ. При этом культуральную среду не удаляют до окончания процесса. Периодическое добавление субстрата приводит к удлинению экспоненциальной и стацинарной фаз, к увеличению биомассы и количества метаболитов, синтезируемых во время стационарной фазы. Для обеспечения непрерывного синтеза рекомбинантного белка и его стабильности необходим тщательный контроль процесса и добавление субстрата (источника углерода, азота, витаминов, микроэлементов и др. БАВ) тотчас, как в этом возникает необходимость.

В зависимости от генотипа микроорганизма и природы рекомбинантного белка периодическая ферментация с добавлением субстрата может повысить выход готового продукта на 25-1000% по сравнению с простой периодической ферментацией.

Периодическая ферментация с добавлением субстрата используется также для культивирования клеток млекопитающих и насекомых; эти културы широко применяют для получения белковых продуктов, имеющих медицинское значение, кроме того, без периодического добавления субстрата, клетки млекопитающих неэффективно синтезируют чужеродные белки. Для периодической ферментации характерны небольшие различия во времени сбора клеток, который проводят, начиная с середины экспоненциальной фазы, и заканчивают ее поздним этапом.

Однако в стационарной фазе микроорганизмы часто синтезируют протеолитические ферменты - протеиназы, разрушающие производимые белки; если цель ферментации – получение белковых продуктов, нужно остановить процесс до перехода его в стационарную фазу. Определяя время добавления следующей порции субстрата, используют показатели, коррелирующие с его расходом: количество синтезированных органических кислот, значение рН или количество образовавшегося СО₂ . Конечный продукт собирают по завершении процесса.

При непрерывной ферментации свежая культуральная среда поступает в ферментер непрерывно, параллельно отводится такой же объем клеточной суспензии. Таким образом, убыль числа клеток (удаление продукта) уравновешивается их увеличением в результате деления. При этом жестко контролируют скорость притока культуральной среды и постоянный объем культуры в биореакторе.

Следует заметить, что в промышленных целях непрерывная ферментация применяется реже, хотя стоимость получения определенного количества биомассы в ферментере непрерывного действия существенно ниже, чем в биореакторе, работающем в периодическом режиме. Это удешевление обусловлено следующим:

- при непрерывной ферментации нужны не столь громоздкие биореакторы и оборудование для сбора клеток, их разрушения, последующей очистки белкового продукта или метаболита, синтезированного микроорганизмами;

- биореактор периодического действия время от времени разгружают, готовя к повторному использованию (ремонт, чистка, стерилизация биореактора - основная причина снижения эффективности процесса); для ферментера, работающего в непрерывном режиме, простой существенно меньше;

- при непрерывной ферментации синтез целевого продукта происходит более согласованно, так как физиологический статус большинства клеток одинаков.

Непрерывную ферментацию используют для промышленного получения белков одноклеточных микроорганизмов и антибиотиков, однако и этот способ выращивания микроорганизмов связан с определенными затруднениями:

· продолжительность ферментации в непрерывном режиме составляет иногда 500-1000 ч, в течение которого некоторые клетки могут потерять рекомбинантные плазмиды (известно, что клетки, не несущие плазмид, расходуют меньше энергии, делятся быстрее, поэтому со временем выход целевого продукта может снижаться из-за уменьшения числа клеток, способных его синтезировать);

· в промышленных установках затруднительно в течение длительного времени поддерживать стерильные условия; непрерывные процессы требуют наличия стерильного резервного оборудования, что значительно увеличивает основные затраты.

Культуры с высокой плотностью. При максимальной конечной плотности культуры получается и максимальное количество целевого продукта. В ферментерах периодического действия с добавлением субстрата концентрация рекомбинантных клеток E.coli достигает 50 г сухого вещества на 1 л питательной среды (в некоторых случаях более 100 г/л). Один из способов повышения плотности культуры- оптимизация культуральной среды.

Следует иметь в виду, что некоторые питательные вещества (в том числе источники углерода, азота) при высоких концентрациях замедляют рост клеток. Так, глюкоза подавляет рост при концентрации более 50 г/л, аммиак- при концентрации свыше 3 г/л; железо, магний, фосфор, цинк соответственно – более 1,15 г/л, 8,7 г/л, 10 г/л, 0,038 г/л.

Таким образом, простое увеличение содержания питательных веществ в культуральной среде при периодической ферментации не дает желаемого результата.

Для избежание недостатка кислорода в культурах с высокой плотностью повышают количество поступающего диспергированного воздуха и скорость перемешивания. Возможна подача в культуру чистого кислорода, а не воздуха (содержащего только 20% кислорода) или выращивание клеток под определенным давлением для увеличения растворимости кислорода. Высокой плотности роста культуры удается достичь в периодическом режиме с добавлением субстрата. Режим подачи питательных веществ может быть: непрерывным, ступенчатым, экспоненциальным.

При непрерывном режиме в культуральную среду в течение всей ферментации вносят одинаковые количества питательных веществ. При ступенчатом режиме питательные вещества добавляют во все большем количестве по мере увеличения концентрации клеток. При экспоненциальном режиме питательные вещества добавляют в количестве, обеспечивающем постоянную скорость роста клеток.

Периодическую подачу питательных веществ автоматизируют, основываясь на результатах измерения концентрации лимитирующего субстрата культуральной среды (например, глюкозы) в процессе ферментации.

При крупномасштабной ферментации следует учитывать еще один аспект. Важно не допустить случайного попадания рекомбинантных микроорганизмов в окружающую среду; для этого используют надежные системы, предотвращающие утечку живых рекомбинантных организмов или ограничивающие их распространение при произошедшей утечке.

Перед окончательным удалением из установки, все рекомбинантные микроорганизмы должны быть инактивированы в соответствии с определенными инструкциями. Использованную культуральную среду тщательно проверяют на наличие в ней жизнеспособных микроорганизмов, чтобы исключить их попадания в окружающую среду.

Дата добавления: 2014-01-04