Моделирование процесса денитрификации в лабораторных условиях

Денитрификация (нитратное дыхание)

Вводные пояснения. Нитратное дыхание происходит с использованием связанного кислорода нитрата. Многие бак­терии в актах дыхания восстанавливают нитрат с выделением молекулярного азота (N₂) или закиси азота (N₂O). Этот про­цесс диссимиляционного восстановления нитрата получил на­звание денитрификации. В процессе денитрификации органи­ческие субстраты окисляются до СО₂ и Н₂О. Суммарно этот процесс можно выразить следующим уравнением:

С₆Н₁₂О₆ + 4NO^-₃ = 6СО₂ + 6Н₂О + 2N₂

Микроорганизмы, осуществляющие процесс денитрифи­кации, широко распространены в природе. Большинство их относится к родам Pseudomonas (P. fluorescens, P. stutzeri). Paracoccus (P. denitrificans). Процесс идет в основном в анаэробных условиях.

Постановка опыта. Для воспроизведения в лабораторных условиях процесса денитрификации и получения накопительной культуры денитрифицирующих бактерий обычно пользу­ются средой Гильтая (см. 10.2.2) или средой более простого состава (г/л дистиллированной воды): сегнетова соль (натриевокалиевая соль винной кислоты) или цитрат натрия — 20; KNO₃ - 2,0; К₂НРО₄ - 0,5; MgSO₄ · 7H₂O – 0,2; FeSO₄ • 7Н₂О — следы.

В склянку или колбу Эрленмейера наливают немного питательной среды и добавляют к ней '/₃ чайной ложки поч­вы. Среду тщательно перемешивают с почвой для удаления пузырьков воздуха, затем наполняют склянку или колбу пита­тельной средой до края и закрывают каучуковой пробкой, в которую вставлена открытая с двух сторон стеклянная трубка, расширенная в средней части. Пробка вытесняет часть жидкос­ти в стеклянную трубку (рис. 24).

	Рисунок 24 -Прибор для культи­вирования денитрифицирую­щих бактерий: 1 — ватная пробка; 2 — слой вазелинового масла; 3 - каучуковая пробка

Под пробкой не должны ос­таваться пузырьки воздуха. В трубку над средой наливают ва­зелиновое масло небольшим сло­ем для создания анаэробных ус­ловий. Отсутствие углеводов в среде исключает процесс броже­ния. В полученных условиях в первую очередь будут развивать­ся лишь микроорганизмы, спо­собные использовать связанный в соединениях кислород нитрата.

При постановке опыта на­личие в среде нитрата устанавли­вают капельной реакцией с дифе­ниламином (см. 8.2.2).

Прибор со средой и почвой помещают в термостат при тем­пературе 28—30 ºС. После 5— 6 дней инкубации культуру подвергают анализу: отмечают появление пузырьков газа под пробкой и цвет среды.

Результаты опыта. Для микроскопирования возбудителей денитрификации из середины субстрата чистой пипеткой бе­рут каплю и готовят фиксированный и окрашенный препарат, который затем рассматривают под микроскопом с иммерси­онной системой.

На препарате преобладают неспорообразующие сфериче­ские клетки или короткие палочки Paracoccus denitrificans. Не­редко наблюдается позеленение среды, особенно при исполь­зовании углерода лимонной кислоты, что указывает на разви­тие Pseudomonas fluorescens. На среде с сегнетовой солью чаще развивается P. stutzeri.

Для определения продуктов жизнедеятельности денитри­фицирующих бактерий из культуральной жидкости делают пробы: на нитрат — с дифениламином, на нитрит — с цинк-иод-крахмалом в кислой среде или с реактивом Грисса и на аммиак — с реактивом Несслера.

Обычно после 6 сут инкубации реакции на нитрат и ни­трит бывают отрицательными. С реактивом Несслера субстрат показывает положительную реакцию (капля окрашивается в желтовато-оранжевый цвет). Основная масса азота нитрата восстанавливается до молекулярного азота, о чем свидетельст­вует обильное образование газов (СО₂ и N₂). Наличие амми­ака подтверждает то, что эти же бактерии вызывают аммони­фикацию нитрата, ассимилируя аммиак в качестве источника азота.

Дата добавления: 2014-01-04