Основные белки хроматина - гистоны

Роль ДНК в составе как интерфазных хромосом (хроматин интерфазного ядра), так и митотических хромосом достаточно ясна: хранение и реализация генетической информации. Однако для выполнения этих функций в составе интерфазных ядер необходимо иметь четкую структурную основу, которая позволила бы расположить огромные по длине молекулы ДНК в строгом порядке, чтобы с определенной временной последовательностью протекали процессы как синтеза РНК, так и редупликации ДНК В интерфазном ядре концентрация ДНК достигает 100 мг/мл (!). В среднем на интерфазное ядро млекопитающих приходится около 2 м ДНК, которая локализуется в сферическом ядре со средним диаметром около 10 мкм. Это значит, что такая огромная масса ДНК должна как-то быть уложена с коэффициентом упаковки 1 х 10³--1 х 10⁴. И при этом в ядре должен сохраниться определенный порядок в расположении частично или полностью деконденсированных хромосом. И кроме того, должны быть реализованы условия для упорядоченного функционирования хромосом. Ясно, что все эти требования не могут быть осуществлены в бесструктурной, хаотической системе.

В клеточном ядре ведущую роль в организации расположения ДНК, в ее компактизации и в регулировании функциональных нагрузок принадлежит ядерным белкам. Как уже указывалось, хроматин представляет собой сложный комплекс ДНК с белками, дезоксирибонуклеопротеин (ДНП), где на долю белков приходится около 60% от сухого веса. Белки в составе хроматина очень разнообразны, но их можно разделить на две группы: гистоны и негистоновые белки. На долю гистонов приходится до 80% от всех белков хроматина. Их взаимодействие с ДНК происходит за счет солевых или ионных связей и неспецифично в отношении состава или последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК. Несмотря на преобладание в общем количестве, гистоны представлены небольшим разнообразием белков: эукариотические клетки содержат всего 5-7 типов молекул гистонов. В отличие от гистонов, т.н. негистоновые белки большей частью специфически взаимодействуют с определенными последовательностями молекул ДНК, очень велико разнообразие типов белков, входящих в эту группу (несколько сот), велико разнообразие функций, которые они выполняют.

Гистоны связаны с ДНК в виде молекулярного комплекса, в виде субъединиц или нуклеосом. До этого считалось, что ДНК равномерно покрыта этими белками, связь которых с ДНК определяется свойствами гистонов.

Гистоны – белки характерные только для хроматина, обладают рядом особых качеств. Это основные или щелочные белки, свойства которых определяются относительно высоким содержанием таких основных аминокислот как лизин и аргинин. Именно положительные заряды на аминогруппах лизина и аргинина обусловливают солевую или электростатическую связь этих белков с отрицательными зарядами на фосфатных группах ДНК. Эта связь достаточно лабильна, легко нарушается, в этом случае может происходить диссоциация ДНП на ДНК и гистоны. Поэтому хроматин, дезоксирибонуклеопротеин или ще как называли раньше, нуклеогистон, является сложным нуклеиново-белковым комплексом, в который входят линейные высокополимерные молекулы ДНК и огромное множество молекул гистонов (до 60 млн. копий каждого типа гистонов на ядро).

Гистоны – наиболее хорошо биохимически изученные белки (см. табл. 5).

Таблица 5. Общие свойства гистонов млекопитающих

Гистон	Мол. вес	Основные аминокислоты, %	Кислые аминокислоты, %	Отношение основных аминокислот к кислым
Лизин	Аргинин
H1 H2A H2B H3 H4	23 000 13 960 13 770 15 340 11 280				5,4 1,4 1,7 1,8 2,5

Гистоны – относительно небольшие по молекулярной массе белки. Эти белки практически у всех эукариот обладают сходными свойствами, обнаруживаются одни и те же классы гистонов. Классы гистонов отличаются друг от друга по содержанию разных основных аминокислот. Так гистоны H3 и H4 относят к аргинин-богатым, из-за относительно высокого содержания в них этой аминокислоты. Эти гистоны являются наиболее консервативными из всех исследованных белков: их аминокислотные последовательности практически одинаковы даже у таких отдаленных видов как корова и горох (всего две аминокислотных замены).

Два других гистона H2A и H2B относятся к умеренно обогащенным лизином белкам. У различных объектов внутри этих групп гистонов обнаруживаются межвидовые вариации в их первичной структуре, в последовательности аминокислот.

Гистон H1, представляет собой не уникальную молекулу, а класс белков, состоящих из нескольких достаточно близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. У этих гистонов обнаружены значительные межвидовые и межтканевые вариации. Однако их общим свойством является обогащенность лизином, что делает их самыми основными белками, которые легко отделяются от хроматина в солевых (0,5 М) растворах. В растворах с высокой ионной силой (1-2 М NaCI) все гистоны полностью отделяются от ДНК и переходят в раствор.

Для гистонов всех классов (особенно для H1) характерно кластерное распределение основных аминокислот, лизина и аргинина, на N- и C-концах молекул. Срединные участки молекул гистонов образуют несколько (3-4) a-спиральных участка, которые компактизуются в глобулярную структуру в изотонических условиях (рис. 56). По-видимому, богатые положительными зарядами неспирализованные концы белковых молекул гистонов и осуществляют их связь друг с другом и с ДНК.

У гистона H1 наиболее вариабельным является N-конец, осуществляющий связь с другими гистонами, а C-конец, богатый лизином, взаимодействует с ДНК.

В процессе жизнедеятельности клеток могут происходить посттрансляционные изменения (модификации) гистонов: ацетилирование и метилирование некоторых остатков лизина, что приводит к потере числа положительных зарядов, и фосфорилирование сериновых остатков, приводящее к появлению отрицательного заряда. Ацетилирование и фосфорилирование гистонов может быть обратимым. Эти модификации значительно меняют свойства гистонов, их способность связываться с ДНК. Так повышенное ацетилирование гистонов предшествует активации генов, а фосфорилирование и дефосфорилирование связаны соответственно с конденсацией и деконденсацией хроматина.

Гистоны синтезируются в цитоплазме, транспортируются в ядро и связываются с ДНК во время ее репликации в S-периоде, т.е. синтез гистонов и ДНК синхронизированы. При прекращении клеткой синтеза ДНК гистоновые информационные РНК за несколько минут распадаются и синтез гисонов останавливается. Включившиеся в хроматин гистоны очень стабильны, имеют низкую скорость замены.

Подразделение гистоноы на пять групп и достаточное сходство их внутри каждой группы в целом характерно для эукариот. Однако целый ряд отличий в составе гистонов наблюдается как у высших, так и у низших эукариотических организмов. Так у низших позвоночных вместо H1, характерного для всех тканей этих организмов, в эритроцитах находят гистон H5, который содержит больше аргинина и серина. С другой стороны, наблюдается отсутствие некоторых групп гистонов у ряда эукариот, и в целом ряде случаев полная замена этих белков на другие.

Гистоноподобные белки были обнаружены в составе вирусов, бактерий, митохондрий. Так, например, у E. coli в клетке в большом количестве обнаруживаются белки (HU и H-NS), по аминокислотному составу напоминающие гистоны.

Функциональные свойства гистонов

Широкое распространение гистонов, их сходство даже у очень отдаленных видов, обязательность вхождения их в состав хромосом, все это говорит об их чрезвычайно важной роли в процессе жизнедеятельности клеток. Еще до открытия нуклеосом существовало две взаимодополняющие друг друга группы гипотез о функциональной роли гистонов, о регуляторной и структурной их роли.

Было обнаружено, что выделенный хроматин при добавлении к нему РНК-полимеразы может быть матрицей для транскрипции, однако активность его составляет всего лишь около 10% от активности, соответствующей активности выделенной чистой ДНК. Эта активность прогрессивно возрастает по мере удаления групп гистонов и может достичь 100% при полном удалении гистонов. Отсюда можно было сделать вывод, что общее содержание гистонов может регулировать уровень транскрипции. Это наблюдение совпадает с тем, что по мере удаления гистонов, особенно H1, происходит прогрессивная деконденсация, разворачивание фибрилл ДНП, что возможно облегчает взаимодействие РНК-полимеразы с матричной ДНК. Так же было обнаружено, что модификация гистонов приводит к усилению транскрипции и одновременной декомпактизации хроматина. Следовательно, напрашивается вывод о том, что количественное и качественное состояние гистонов влияет на степень компактности и активности хроматина. Однако оставался открытым вопрос о специфичности регуляторных свойств гистонов: какова роль гистонов при синтезе специфических иРНК в различно дифференцированных клетках. Этот вопрос до сих пор еще не решен, хотя можно сделать некоторые обобщения: на эту роль могут претендовать те группы гистонов, которые наименее консервативны, такие как H1 или как H2A и H2B, которые могут в значительной мере модифицироваться и тем самым изменять свои свойства в определенных участках генома.

Была очевидна и структурная, компактизирующая, роль гистонов в организации хроматина. Так постепенное добавление фракции гистонов к растворам чистой ДНК приводит к выпадению в осадок комплекса ДНП, и наоборот, частичное удаление гистонов из препаратов хроматина, ведет к его переходу в растворимое состояние. С другой стороны, в цитоплазматических экстрактах ооцитов земноводных или яиц морских ежей, содержащих свободные гистоны, добавление любой ДНК (включая фаговую) привводит к образованию хроматиновых фибрилл (ДНП), длина которых в несколько раз короче исходных ДНК. Эти данные говорят о структурной, компактизирующей роли гистонов. Для того, чтобы огромные сантиметровые молекулы ДНК уложить по длине хромосомы, имеющей размер всего несколько микрометров, молекула ДНК должна быть как-то скручена, компактизована с плотностью упаковки равной 1: 10000. Оказалось, что в процессе компактизации ДНК существуют несколько уровней упаковки, первые из которых прямо определяются взаимодействием гистонов с ДНК.

Первый уровень компактизации ДНК: структурная роль нуклеосом

В ранних биохимических и электронномикроскопических работах было показано, что препараты ДНП содержат нитчатые структуры с диаметром от 5 до 50 нм. Постепенно стало ясно, что диаметр фибрилл хроматина зависит от способа выделения препарата.

На ультратонких срезах интерфазных ядер и митотических хромосом после фиксации глутаровым альдегидом обнаруживались хроматированные фибриллы толщиной 30 нм. Такие же размеры имели фибриллы хроматина при физической фиксации ядер - при быстром замораживании ядер, скалывании объекта и получении реплик с таких препаратов. В последнем случае исключалось воздействие на хроматин переменных химических условий. Но все эти методы и приемы не давали никакой информации о характере локализации ДНК и гистонов в хроматиновых фибриллах.

Крупным событием в изучении хроматина было открытие двумя разными способами нуклеосом - дискретных частиц хроматина. Так при осаждении на подложку для электронной микроскопии препаратов хроматина в щелочных условиях при низкой ионной силе, можно было видеть, что нити хроматина представляли собой что-то, напоминающее “бусы на нитке”: небольшие, около 10 нм, глобулы, связанные друг с другом отрезками ДНК длиной около 20 нм (рис. 57, 58). Эти наблюдения совпадали с результатами фракционирования хроматина после частичного нуклеазного переваривания.

Было найдено, что если подвергнуть действию нуклеазы микрококков выделенный хроматин, то он подвергается распаду на регулярно повторяющиеся структуры. Так ДНК, полученная из хроматина, обработанного нуклеазой, состояла из серии отрезков, кратных 200 парам оснований; встречались отрезки в 200, 400, 600, 800 и больше пар нуклеотидов (п.н.). Это говорит о том, что нуклеазной атаке в составе хроматина подвергаются участки ДНК, расположенные примерно через каждые 200 п.н. При этом в кислоторастворимую фракцию (низкополимерная) ДНК уходит всего 2% ядерной ДНК. Кроме того после такой нуклеазной обработки из хроматина путем центрифугирования удается выделить фракцию частиц со скоростью седиментации 11S (S - единица Сведберга, определяющая скорость седиментации частиц, равна 1 х 10^-13 с), а также частицы кратного этой величине размера: димеры, тримеры, тетрамеры и т.д. Оказалось, что частицы 11S содержат ДНК около 200 п.н. и восемь гистонов (октамер) по две копии гистонов H2A, H2B, H3 и H4 и одну копию гистона H1. Такая сложная нуклеопротеидная частица получила название нуклеосомы. Более подробный анализ этой фракции показал, что нуклеосома устроена следующим образом: октамер гистонов образует белковую основу-сердцевину (от англ. core, часто в нашей литературе этот термин используется без перевода: кор, коровая частица), по поверхности которой располагается ДНК величиной в 146 п.н., образующая 1,75 оборота; остальные 54 п.н. ДНК образуют участок, несвязанный с белками сердцевины - линкер, который, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит в ДНК следующей нуклеосомы. Гистон H1 связывается частично с основной, сердцевиной и с участком линкера (около 30 п.н.). Следовательно, полная нуклеосома содержит около 200 п.н. ДНК (146 п.н.- сердцевина, 30 п.н. - участок линкера в комплексе с гистоном H1, 30 п.н. - свободная ДНК), октамер сердцевинных (коровых) гистонов и одну молекулу гистона H1 (рис. 59). Молекулярная масса полной нуклеосомы - 262000 Да. Рассчитано, что на весь гаплоидный геном человека (3 х 10⁹ пар оснований) приходится 1,5 х 10⁷ нуклеосом.

Сердцевина или коровая частица (или минимальная нуклеосома) очень консервативны по своей структуре: они всегда содержат 146 п.н. ДНК и октамер гистонов. Линкерный участок может значительно варьировать (от 8 до 114 п.н. на нуклеосому).

Используя метод рассеяния нейтронов удалось установить форму и точные размеры нуклеосом. При грубом приближении – это плоский цилиндр или шайба диаметром 11 нм и высотой 6 нм. Располагаясь на подложке для электронного микроскопирования они образуют «бусины», глобулярные образования около 10 нм, гуськом, тандемно сидящие на вытянутых молекулах ДНК. На самом же деле вытянутыми являются только линкерные участки, остальные три четверти длины ДНК спирально уложены по периферии гистонового октамера. Сам гистоновый октамер, как считают, имеет форму, напоминающую мяч для игры в рэгби, в состав которого входит тетрамер (H3 · H4)₂ и два независимых димера H2A · H2B. На рис. 60 представлена схема расположения гистонов в сердцевинной части нуклеосомы.

В фибриллах хроматина линкерный участок не линеен, а продолжая спираль ДНК на поверхности нуклеосомной частицы,связывает соседние нуклеосомы так, что образуется как бы сплошная нить, толщиной около 10 нм, состоящая из тесно расположенных нуклеосом (рис. 61). При этом за счет дополнительной спирализации ДНК (1 отрицательный супервиток ДНК на 1 нуклеосому) происходит первичная компактизация ДНК, с плотностью упаковки равной 6-7 (200 п.н. длиной 68 нм, уложены в глобулу диаметром 10 нм). Укладка почти двух витков ДНК по периферии сердцевин нуклеосомы происходит, как считается, за счет взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков на поверхности октамера гистонов с фосфатами ДНК. N- и C-концевые участки сердцевинных гистонов, обогащенные положительными зарядами, вероятно, служат для дополнительной стабилизации структуры нуклеосомы.

Ведущая роль сердцевинных (коровых) белков в компактизации ДНК показана при самосборке нуклеосом. Регулируя последовательность добавления гистонов и ДНК, удалось получить полную реконструкцию нуклеосом. В этом процессе не играет никакой роли источник, откуда была взята ДНК: это может быть ДНК бактерии и даже циклическая ДНК вирусов. Оказалось, что для образования нуклеосом гистон H1 не требуется, он участвует в связывании уже готовых нуклеосом друг с другом и в образовании более высоких уровней компактизации ДНК. Ключевыми в построении нуклеосом оказались гистоны H3 и H4. При этом вначале ДНК связывается с тетрамером (H3 · H4)₂ к которому позжеприсоединяются два димера H2A · H2B. Вероятно, высокая консервативность в строении гистонов H3 и H4 отражает их ведущую структурную роль на первых этапах компактизации ДНК при образовании нуклеосом.

Дата добавления: 2014-01-06