Методы проявления

Методы нанесения пробы анализируемого вещества на пластинку

Целью проявления хроматограммы является визуализация всех имеющихся на ней пятен. Чем меньше минимальное количество вещества, которое удается обнаружить при применении того или иного метода проявления, тем выше чувствительность этого метода. При изучении физико-химических свойств веществ чувствительность обнаружения значения не имеет. Напротив, чем выше чувствительность обнаружения веществ, являющихся нежелательными примесями, например, в лекарственном препарате, тем на более высоком уровне можно контролировать качество продукта. Метод обнаружения зависит, прежде всего от спектральных свойств веществ в видимом или УФ-диапазоне.

Неокрашенные вещества, хорошо поглощающие УФ-излучение в области 254 и/или 365 нм (производные полициклических карбо- и гетероциклических соединений), удается обнаружить в достаточно малых количествах на пластинках с флуоресцентным индикатором. Так, примеси флуореновой природы в амиксине (коэффициент молярной экстинкции при 254 нм 50000 – 100000) обнаруживаются в количествах 0.05 – 0.1 мкг в зависимости от фирмы-производителя пластинок в виде темно-фиолетовых пятен на голубом или голубовато-зеленом фоне флуоресценции индикатора на пластинке. Если вещество само способно флуоресцировать при возбуждении УФ-светом, то предел его обнаружения на пластинках без флуоресценитного индикатора, как правило, значительно ниже. Так, изомерные 9-метоксиакридин и 10-метилакридон могут быть обнаружены в количествах 0.001 – 0.01 мкг, причем цвет их флуоресценции различается, что дает возможность различить эти два вещества даже в тех случаях, когда их R_f совпадают.

Окрашенные вещества в большинстве случаев дают хорошо различимые визуально пятна, однако чувствительность их обнаружения, как правило, ниже, чем под УФ-облучением. Так, чувствительность обнаружения амиксина под УФ-светом более чем в 10 раз превышает чувствительсность его обнаружения в видимом свете, а упомянутых выше 9-метоксиакридина и 10-метилакридона – в 100 – 1000 раз.

Если вещество не способно поглощать УФ-свет при 254 и 365 нм (или эффективность поглощения мала) и при этом неокрашено, то для его обнаружения необходимо применять специальные реагенты. Реагенты делятся на общие, групповые и индивидуальные.

К общим реагентам относятся йод, серная кислота при нагревании, сильные окислители в кислой среде. К наиболее популярным относится иод. Преимущества его обусловлены безопасностью, экпрессностью и простотой применения. Хроматограмму можно проявлять в герметичной емкости, в которой помещено небольшое количество кристалличего иода. Кирхнер рекомендует раствор иода в метаноле или гексане. Одним из наиболее удобных представляется способ, при котором иод адсорбируют встряхиванием кристаллического иода с сорбентом, а хроматограмму проявляют ее обсыпанием полученным проявителем. Если обнаруживаемое вещество обладает заметной липофильностью, то получают коричневые пятна (темно-синие – на слоях с крахмалом в качестве связующего после увлажнения пластинки парами воды). Сильногидрофильные вещества, напротив оказываются менее окрашенными, чем фон. Сильные восстановители (например, гидразины, полиаминобензолы, полифенолы) дают ярко-белые пятна на бледноокрашенном фоне. Подробный список реагентов общего назначения и методов их применения приведен в монографии Ю. Кирхнера.

К групповым реагентам относятся реагенты, обработка хроматограммы которыми приводит к появлению специфической окраски пятен веществ, содержащих определенные функциональные группы.

Так раствор нингидрина в кислой среде проявляет пятна аминокислот как темно-филетовые. Вещества, содержащие амидные группы (вместо аминов) не окрашиваются. Последние так же как и амины дают синие пятна после обработки хроматограммы газообразным хлором с последующим опрыскиванием иод-толуидиновым реактивом. Первичные амины (в том числе и анилины) дают желто-оранжевые пятна при опрыскивании хроматограммы раствором 9-метоксиакридина в метаноле с последующим нагревом пластинки. Под действием этого же реактива пятна гидразинов и гидразидов приобретают окраску от желтой до красно-оранжевой немедленно без нагревания. Сам гидразин обнаруживается в виде темно-красного пятна. Фенолы (и некоторые сильные восстановители) образуют ярко синие пятна при обработке смесью растворов Na₃[Fe(CN)₆] и FeCl₃, причем яркость окраски и, следовательно, чувствительность определения возрастают с увеличением числа гидроксильных групп в соединении. Так, 4,4'-дигидроксидифенил-2-карбоновая кислота (полупродукт в синтезе амиксина) обнаруживается таким образом в количествах около 1 нг.

Таким образом, использование проявляющих реактивов позволяет не только визуализывать пятна веществ на хроматограмме, но и определить в их составе весь набор основных функциональных групп. Нанесение на широкую пластинку стартового пятна в виде полосы позволяет после элюции, высушивания и разрезания хроматограммы на отдельные узкие полоски применить множество разных реактивов для проявления.

Основные реагенты

Дата добавления: 2014-12-27