Окрашивание соединительной и мышечной тканей

Окрашивание соединительной и мышечной тканей по методу ван Гизона.

Приготовление красителя Романовского-Гимзы.

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 — 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.

Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.

Специальный стандартный раствор Гимза

Состав красителя:

Азур 1 — 3,772 г

Эозин — 2,165 г

Метиленовая синька (медиц.) — 1,563 г

Метанол (ЧДА) — 750,0 мл

Глицерин (ЧДА) — 256,0 мл

Методика окраски

Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.

Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.

В настоящее время используется готовый краситель Романовского-Гимзе, из которого перед началом работы готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.

Высохший фиксированный мазок помещается в кювету с рабочим раствором краски на 25-40 минут (конкретное время устанавливается опытным путем для каждой партии красителя).

Ядра клеток - красно-фиолетовые;

Эозинофильные гранулы - красновато-коричневые;

Базофильные гранулы - синие;

Нейтрофильные гранулы - фиолетовые;

Цитоплазма лимфоцитов - голубая;

Эритроциты - бледно-красные;

Тромбоциты - наружная часть синяя (более светлая); внутренняя - фиолетовая (более темная).

Окраска соединительной и мышечной тканей гематоксилин-пикрофуксином по методу Ван - Гизона широко используется в гистологической практике как для получения обзорных препаратов, так и для некоторых специальных целей. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с окраской гематоксилин-эозином, так как по-разному окрашивает различные ткани. Так, соединительная ткань после окраски пикрофуксином имеет ярко-красный цвет, а все остальные ткани - буровато-желтый или желто-зеленый. Метод Ван-Гизона позволяет отдифференцировать гладкомышечные клетки от соединительнотканных в тех случаях, когда их трудно различить на препаратах, окрашенных другими методами. В качестве ядерной окраски применяется железный гематоксилин Вейгерта, дающий черную или буро-черную окраску ядер. Можно использовать любой гематоксилин.

Раствор пикрофуксина готовят следующим образом: к 100мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты прибавляют 5-10 мл 1% водного раствора кислого фуксина.

Если нужно срочно приготовить очень небольшое количество раствора, то в пузырек из-под пенициллина наливают профильтрованный насыщенный раствор пикриновой кислоты (половину пузырька) и к нему по каплям прибавляют 1% раствор кислого фуксина. При этом контролем может служить капля смеси на фильтровальной бумаге, которая должна иметь цвет свежей крови.

Окрашивание:

1. Из дистиллированной воды срезы перенести в гематоксилин на 2-5 мин. Окраску ядер надо контролировать под микроскопом.

2. Ополоснуть срезы в дистиллированной воде и перенести в водопроводную воду на 10 мин (воду нужно сменить).

3. Поместить срезы на 1-2-3 мин (иногда на 1/2 мин) в пикрофуксин.

4. Быстро (5-10 с) сполоснуть срезы в дистиллированной воде, провести их очень быстро через 96% спирт (можно сменить), просветлить в карбол-толуоле, толуоле и заключить в канадский бальзам.

Результат: коллагеновые волокна ярко-красного цвета, а мышечные и эластические - буровато-желтого или желто-зеленого. Ядра буро-коричневого или буро-черного цвета.

Особенности окраски. Необходим постоянный контроль под микроскопом. Если ядра приобретают бурый, а не черный цвет, то следует дольше подержать срезы в гематоксилине или меньше в пикрофуксине, так как пикрофуксин обладает сильно дифференцирующим действием в отношении гематоксилина.

Существенным недостатком этого метода является выцветание препаратов, поэтому их нельзя хранить длительное время. Следует заметить, что в общем методика эта капризна и непостоянна. Из ряда моментов, определяющих успех или неуспех реакции, главным следует считать качество красителя: только при применении красителя высокого качества можно ожидать четкой и красивой реакции. Большое значение имеет также качество дистиллированной воды. Иногда во время споласкивания срезов в дистиллированной воде цвет окраски изменяется. В таком случае необходимо заменить воду. Вообще следует работать по возможности с дважды дистиллированной водой.

Надо учитывать, что интенсивность окраски коллагеновых волокон зависит от плотности соединительной ткани и зрелости волокон. В зрелых волокнах плотность расположения молекул коллагена в протофибриллах и фибриллах, а фибрилл в самих волокнах выше, чем в незрелых. Вследствие этого создаётся более высокая концентрация химических групп белка, обеспечивающих связь с красителем, и уменьшается его диффузия. Незрелые волокна, богатые содержащим углевод цементирующим веществом, не окрашиваются. Беспорядочное расположение фибрилл и содержание большого количества протеогликанов также способствует снижению интенсивности окрашивания (например, хрящевая ткань). Денатурация коллагена, ведущая к разворачиванию спиральной структуры молекулы, как в желатине, также ослабляет окраску. В связи с этим, участки соединительной ткани, где отмечается фибриноидная или другая дезорганизация, имеют слабую окраску.

Дата добавления: 2014-01-15