Лабораторная работа 15. Определение нарастания аминоазота в процессе автолиза

Расчет количественного содержания белка в исследуемом растворе

Определение содержания азота

Построение калибровочной кривой для определения концентрации азота

Для построения калибровочной кривой в десять пронуме­рованных пробирок наливают стандартный раствор сульфата аммония от 1 до 10 мл, в девяти пробирках доводят объем до 10 мл до­бавлением дистиллированной воды. Во все про­бирки приливают по 1 мл 50 % раствора сегнетовой соли и 1 мл реактива Несслера, перемешивают. Выдержи­вают 15 мин при комнатной температуре и фотометрируют при длине волны 435 нм против контроля (вместо раствора сульфата аммония берут 10 мл дистиллированной воды). Схема приготовления проб для построения калибровочной кривой представлена в таблице 7.

Таблица 7 - Схема приготовления проб для построения калибровочной кривой

Номер пробы	Раствор сульфата аммония, мл	Дист. вода, мл	Концентрация азота с учетом развед., мкг/мл	Раствор сегнетовой соли, мл	Реактив Несслера, мл	D435
			0,5
			1,0
			1,5
			2,0
			2,5
			3,0
			3,5
			4,0
			4,5
		-	5,0
Контроль	-		-

По полученным значениям оптических плотностей строят калибровочную кривую (рису­нок 2).

D435

N, мкг/мл

Рисунок 2 – Калибровочная кривая для определения азота

Определение содержания азота в исследуемых пробах (мкг/мл) проводят по калибровочной кривой (рис. 2). Расчет содержания общего азота в 100 мл исследуемого неразведенного раствора проводят по формуле:

Nобщ. ,

где:

Nобщ. - количество общего азота в 100 мл исследуемого раствора;

с - количество общего азота в одном мл пробы, найденное по калибровочной кривой, мг;

n - разведение исследуемого раст­вора;

0,25 - объем исследуемого разведенного раствора, взятого для сжигания, мл;

25 - общий объем пробы после сжигания, мл.

Количественное содержание белка в исследуемом препарате или растворе равно количеству общего азота, умноженному на 6,25 (среднее содержание азота в белках составляет 16 %, отсюда 100: 16 = 6,25). Количество белка, равно N общ. х 6,25 /100 мг/мл. Количественное содержание белка в препаратах обычно вычисляют в процентах.

При автолизе под влиянием присутствующих в клетках протеолитических ферментов происходит расщепление клеточных белков на полипептиды и аминокислоты и в автолизате увеличивается количество свободных карбоксильных и аминных групп. Полипептиды и аминокислоты являются амфотерными веществами. В водном растворе они способны диссоциировать как кислоты и как основания, поэтому определить количество кислотных и основных групп методом титрования можно только в том случае, если одна из них будет блокирована.

Принцип метода формолового титрования основан на блокировании свободных аминогрупп формальдегидов и определению количества свободных карбоксильных групп титрованием щелочью. Реакции протекают по следующим уравнениям:

Определяя количество щелочи, пошедшее при формоловом тит­ровании на нейтрализацию свободных карбоксильных групп до начала автолиза и по окончании его, вычисляют, какое количество щелочи связалось с карбоксильными группами вновь образовавшихся полипептидов и аминокислот. Поскольку при разрыве пептидной связи освобождаются аминные и карбоксильные группы в эквивалентных количествах, то по количеству щелочи, пошедшей на нейтрализацию карбоксильных групп, можно определить количество свободных аминогрупп.

Следует иметь в виду, что метиленовые производные аминокислот и полипептидов, образующиеся при нейтрализации автолиза, являются солями очень слабых кислот и сильного основания, и в момент нейтрализации реакция среды автолиза становится щелочной (рН 9,1).

Для титрования следовало бы применять индикатор, меняющий свою окраску при рН 9,1. За неимением такого можно воспользоваться фенолфталеином (зона перехода от рН 8,3 до рН 10,0) и титровать исследуемую жидкость до промежуточного розово-красного окрашивания, соответствующего рН 9,1. При применении фенолфталеина в качестве индикатора для удобства титрования заготовляют сначала контрольную пробу с рН 9,1, жидкость в которой окрашена в розово-красный цвет, и эту контрольную пробу используют для сравнения окраски при титровании опытных проб.

1 Цель работы – определить концентрацию аминного азота в ходе процесса автолиза методом формолового титрования

Дата добавления: 2015-04-24