Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция. Ферменты, участвующие в этих процессах

ДНК может быть выделена из любой ядросодержащей клетки. Этапы выделения:

1. быстрый лизис клетки,

2. удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран,

3. ферментативное разрушение белков и их экстрагирование с помощью фенола и хлороформа.

4. концентрирование самой молекулы ДНК путем преципитации в этаноле.

Из 1 грамма сырой ткани (10⁹ клеток) – 2 мг ДНК. Чаще ДНК выделяют из лейкоцитов крови. 5-20 мл крови помещают в чистую пробирку с гепарином. Отделяют лейкоциты и лимфоциты, разрушают клеточную и ядерную мембраны путем добавления солевых буферов, которые содержат денатурирующие агенты. Лучшие результаты дает фермент протеиназа К с последующей фенол-хлороформной экстракцией, которая разрушает все белки. Затем осаждают в этаноле и растворяют в буферном растворе. Это самый приемлемый способ. Оценку количества ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белого и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(280)/А(260)>1,8. А(280) – оптическая плотность при длине волны – 280 нм. Если это соотношение меньше 1,8, то необходимо процедуру повторить, так как для дальнейшего использования белки должны быть удалены.

В процессе сложного и разнообразного функционирования различных участков хромосом ДНК претерпевают разнообразные, регулируемые и в основе своей обратимые изменения, которые осуществляются с помощью ферментов:

1. ДНК-полимеразы,

2. рестриктазы,

Ферменты, которые осуществляют синтез ДНК – ДНК-полимеразы. В бактериальных клетках и клетках эукариот содержится 3 различные формы ДНК-полимераз. Все они обладают синтезирующей активностью и способны удлинять цепь ДНК в направлении 5’-3’ последовательно прибавляя по одному нуклеотиду к 3-ОН концу цепи. Таким образом, для работы ДНК-полимеразы необходима одноцепочечная м-ДНК с двухнитевым участком на 3’- конце молекулы. В середине должно быть 4 типа дезоксинуклеотид-3-фосфатов (dNTP, где N – A, T, C, G). В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК-полимераза α, которая обладает различными активностями, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3’-5’, что позволяет им исправлять или репарировать дефекты, допущенные при подборе комплиментарных оснований. ДНК-полимераза e.coli способна инициировать репликацию в месте разрыва цепочки ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов – метод ДНК трансляции. Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеарной активностью (рестрикционные эндонуклеазы или рестриктазы) значительно продвинуло возможности генной инженерии и исследований ДНК. In vivo, эти ферменты участвуют в системе распознавания и защиты своих и уничтожения чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6 реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК, и разрезают ее на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, эти места – сайты рестрикции. Количество образовавшихся рестрикционных фрагментов ДНК определятся частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов характером распознавания этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты, тем короче ДНК после рестрикции.

В настоящее время известно более 500 рестриктаз бактериального происхождения. Причем каждый их этих ферментов узнает свою специфическую последовательность. Рестриктазы, выделенные путем биохимической очистки из различных видов бактерий обозначают тремя первыми буквами названия бактерий. В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают 3 класса рестриктаз: часто, средне и редко шипящие. Рестриктазы, узнающие длинные специфические последовательности (8-12) – как правило, редко шипящие, а узнающие короткие последовательности (4-6) – чаще шипящие.

50.Полимеразная цепная реакция (ПЦР): характеристика метода, его этапов, значение.

Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (polymerase chain reaction (PCR)) был разработан Кэрри Мюллисом (фирма «Cetus»,CIIIA) в 1983г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе Госсанэпиднадзора (генотипирование, диагностика инфекционных заболеваний).

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий: денатурация ДНК (расплетание двойной спирали, расхождение нитей ДНК), образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК), синтез новой ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей).

Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis Aquaticus, оптимум работы которой находится в области 70-72°С, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который содержит единичные клетки микроорганизмов, получить достаточное количество ДНК-копий для идентификации их методом электрофореза.

Комплиментарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК-цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Таким образом, метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемого ферментом ДНК-полимераза.

Каждый цикл амплификации включает в себя 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах:

1 этап - денатурация ДНК (расплетание двойной спирали), протекает при 93-95°С в течение 30-10 секунд.

2 этап - присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига 20-60 секунд.

3 этап - достраивание цепей ДНК. Комплиментарное достраивание цепей ДНК происходит от 5 конца к 3 концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК полимеразы (Tag-полимеразой) и происходи при температуре 70-72¹'С. Время протекания синтеза 20-10 секунд. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации амлпликоны служат матрицами для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2^П, где п - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна духцепочечная молекула ДНК, то за 30-10 циклов в растворе накапливается около 10⁸ молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Дата добавления: 2015-04-24