Ускоренные методы исследования воды

Принципы обнаружения в воде патогенных микроорганизмов.

Обнаружить патогенные микробы в воде бывает очень трудно по ряду причин. Во-первых, попав в воду в сравнительно концентрированном виде, они постепенно рассеиваются, частично оседают на дно и погибают под действием неблагоприятных физико-химических факторов, в результате их концентрация резко уменьшается.

Во-вторых, сапрофитная микрофлора водоисточника оказывает подавляющее действие на патогенов не только в самом водоисточнике, но и при росте на питательных средах.

Поэтому при выделении патогенной микрофлоры из воды применяют следующие приемы:

1) Прямой посев на элективные питательные среды.

2) Предварительную концентрацию микробов в небольшом объеме воды и последующий посев на питательные среды.

Концентрацию микробов можно осуществить физическими способами (фильтрацией, центрифугированием, выпариванием), осаждением коагулянтами, осаждением агглютинирующими сыворотками, используя положительный хемотаксис, обнаружение методом «реакция нарастания титра бактериофага», заражение исследуемой водой чувствительных животных. В некоторых случаях приходится использовать комбинированные методы обогащения.

Для индикации патогенных микроорганизмов в воде предложены ускоренные методы, которые являются и более чувствительными и более быстрыми. Наибольшее применение получил метод люминесцентно-серологический, который рекомендуют для обнаружения в воде эшерихий, сальмонелл, шигелл, вибрионов и др. Метод иммунофлуоресценции основан на способности антител, предварительно обработанных различными флорохромами (флуоресцеина изотиоцианат, родамина сульфохлорид, родамина сульфофторид) и др., адсорбироваться на поверхности микробной клетки и вызывать ее свечение. Метод флуоресцирующих антител применяется в трех модификациях – прямой, непрямой и непрямой метод с добавлением комплемента. При прямом методе каплю исследуемой воды, в которой предполагается наличие патогенных бактерий, помещают на предметное стекло, обрабатывают специфичной к искомому микробу люминесцирующей сывороткой и наблюдают под люминесцентным микроскопом. При положительном результате на темном фоне препарата видна яркая люминесценция по периферии клеток. При непрямом методе обработка препаратов происходит в два этапа: специфической иммунной сывороткой выявляют присутствие соответствующих бактерий, на следующем этапе обнаруживают образовавшийся комплекс обработкой меченой иммунной сывороткой, содержащей антитела к глобулинам специфической сыворотки. Этот метод имеет существенное преимущество перед прямым, т.к. для выявления любых бактерий используется одна меченая сыворотка против антител – глобулинов, содержащихся в специфической сыворотке (как правило, глобулинов кролика). При непрямом методе с добавлением комплемента препарат обрабатывают в три этапа: сначала специфической к искомому микробу иммунной сывороткой, затем – комплементом, который адсорбируется на комплексе антиген-антитело, и, наконец, иммунной противокомплементарной флуоресцентной сывороткой. Следует помнить, что после обработки препарата каждым ингредиентом перед нанесением следующего необходимо тщательное промывание – удаление не вступивших в реакцию веществ. Для повышения эффективности метода следует концентрировать бактерии в исследуемой воде на мембранных фильтрах, центрифугированием или посевом в среды обогащения. В этом случае люминесцентно-серологическим методом удается обнаружить энтеробактерии при наличии в пробах воды даже одиночных клеток в 1 мл. Метод флуоресцирующих антител рекомендуется применять при индикации в воде возбудителей туляремии, чумы, бацилл сибирской язвы.

Для ускоренного обнаружения в воде БГКП предложен радиоизотопный метод. Принцип метода заключается в определении количества БГКП по количеству выделяемой ими СО₂ из элективных сред, меченых ¹⁴С. Результат можно получить через 5-6 часов.

1.5. Необходимые материалы:

8 флаконов с концентрированной питательной средой, 3 пробирки с нормальной средой Кесслера или Эйкмана, чашки со средой Эндо или со средой Эндо с молоком, реактив для определения оксидазной активности, среды Гисса полужидкие столбиком с глюкозой, сахарозой, лактозой, среда с триптофаном, реактив Эрлиха или индикаторная бумажка, смоченная щавелевой кислотой, метиленовый красный, среда Козера или Симмонса, КОН 40 %, среда для аммонификации мочевины, индикаторная бумажка красный лакмус или реактив Несслера.

Среда Эйкмана – глюкозо-пептонная среда

Приготовление концентрированной среды: 100 г глюкозы, 100 г пептона, 50 г NaCL, 1 литр дистиллированной воды.

Приготовление нормальной среды: концентрированную среду разбавляют в 10 раз: 10 г глюкозы, 10 г пептона и 5 г NaCL, 1 литр дистиллированной воды.

В том и другом случае растворяют компоненты при подогревании, кипятят, фильтруют, прибавляют глюкозу, доводят объем до 1 л, устанавливают рН 7,4. Нормальную среду разливают в колбы по 10 мл. стерилизуют дробно 3 дня по 30 мин. В пробирки и колбы помещают поплавки или кусочки стерильной ваты (поролона).

Среда Кесслера - лактозо-пептонная среда.

К 1 л водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании 20-30 минут, затем фильтруют через вату, добавляют 10 г лактозы, объем доводят до литра, устанавливают рН 7,4-7,6 и добавляют 4 мл 1 % водного раствора генцианвиолета. Среду разливают в пробирки с поплавками или кусочками стерильной ваты и стерилизуют дробно 3 суток по часу или 15 минут при 120º С. Для приготовления концентрированной среды концентрацию сухих веществ берут в 10 раз больше.

Среда Эндо с молоком. К среде Эндо добавляют 20 % обезжиренного стерильного молока.

Индикатор Андреде. 1 г кислого фуксина вносят в 200 мл дист. воды и взбалтывают до растворения. После этого добавляют 32 мл 1н. раствора NaOH. Через 2-4 часа индикатор готов. Индикатор имеет следующий цвет в зависимости от рН:

Таблица 9.

Зависимость цвета индикатора от рН среды

РН	Цвет индикатора
7,4 и выше	Оранжевый
7,0-7,2	Бледно-розовый
7,0 и ниже	красный

Дата добавления: 2015-07-02