Статистична обробка результатів

Для статистичної обробкивикористовували пакет аналізу даних прикладної програми MS Excel. Для обчислення площі зон дегенерацій використовували двофакторний t-тест з різними дисперсіями. Рівні значущості позначали “*” для P≤0,05, “**” для P≤ 0,01, “***” для P≤0,001.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Лікування нейродегенеративних порушень не лише спадкових, але й тих, що виникли в результаті розвитку органічного ураження мозку, залишається невирішеною проблемою сучасності, адже з кожним роком у світі спостерігається тенденція до зростання кількості людей, які страждають на подібного роду захворювання [1]. Найбільш сумнозвісні нейродегенеративні патології людини (синдром Паркінсона, хвороби Альцгеймера, Хантінгтона, Шарко-Марі-Туз та ін.) пов’язані з втратою великої кількості нейронів у певних ділянках мозку. Вони, як правило, починаються у пострепродуктивному віці та закінчуються передчасною смертю. Деякі гени відповідальні за появу спадкових деменцій, ідентифіковано [2], однак молекулярні характеристики виникнення таких патологій залишаються невідомими, що ускладнює розробку терапії.

Існує низка нових лікарських засобів пептидної природи, що можуть мати терапевтичний ефект у лікуванні як гіпоксичних, так і нейродегенеративних розладів, однак механізм їх дії залишається не до кінця розкритим. Одним із таких засобів є експериментальний нейропротектор Мітохондрин-2 (М-2), отриманий з окремих тканин новонароджених поросят, що пережили гіпоксію під час пологів і який являє собою набір пептидів з молекулярною масою в діапазоні 2500-7000 Да та низки домінуючих амінокислот [3].

Зважаючи на складність проведення клініко-генетичних досліджень у людини, для вивчення природи нейродегенеративних захворювань та пошуку терапевтичних підходів використовують модельні об’єкти. Одним з найкраще вивчених еукаріотичних модельних об’єктів генетики є Drosophila melanogaster. На сьогоднішній день встановлено, що багато описаних генів дрозофіли є ортологами генів людини. Крім того, патологічні зміни в структурі мозку нейродегенеративних мутантів дрозофіли за морфологічними, біохімічними та функціональними характеристиками подібні до таких у людей, які страждають нейропатіями [4]. Тому особливу цінність представляють точкові мутанти дрозофіли із нейродегенеративними змінами у мозку та трансгенні лінії дрозофіли, які дозволяють створювати спрямований функціональний нокаут окремих генів у певних типах клітин, а їх детальне вивчення дає змогу не лише поглибити розуміння генетичної природи патології, але й створює підґрунтя для дослідження експериментальних нейропротекторних препаратів.

Для дослідження дії експериментального препарату М-2 нами було обрано особин із тканинно-специфічною експресією гена Sod1 у гліальній тканині мозку дрозофіли. Відомо, що ген Sod1 характеризується клітинно-специфічною активністю [9, 14]. Серед клітин мозку саме для гліоцитів його функціонування є найбільш вагомим [15]. Використання Gal4-UAS системи тканинно-специфічної експресії дозволяє створювати функціональне інгібування трансляції генного продукту в визначених тканинах або клітинах. Ми створили функціональний нокаут гена Sod1 у гліоцитах, схрестивши дві лінії: в одній під контролем UAS промотора містився конструкт сенс- і антисенс-кодуючі послідовності гена Sod1 (UAS- Sod1-RNAi), а драйверна Gal4 лінія (Repo-Gal4) забезпечувала активацію цього конструкту в гліоцитах. Особини необхідного генотипу (Repo-Gal4/UAS- Sod1-RNAi) одержували у першому поколінні_. Контролем патологічного фенотипу в даному випадку не може слугувати дикий тип, оскільки відомо, що драйверні лінії можуть мати власний неспецифічний фенотип [8, 9]. Тому контролем були особини F₁ від схрещування драйверної лінії з диким типом (Repo-Gal4/+).

У попередніх роботах нашої лабораторії було показано, що як функціональний нокаут, так і надекспресія гена Sod1 у гліальній тканиніпризводять до виникнення нейродегенеративних змін у структурі головного мозку D.melanogaster [12,13]. Нейродегенерація локалізується в очній ділянці мозку і поширюється не лише на нейрони, але і на гліальні клітини – гліоцити (рис.6).

(а)

(б)

Рис. 6. Схеми схрещувань ліній D. melanogaster для отримання тканинно-специфічної експресії гена Sod 1: ( а) − створення функціонального нокауту гена Sod1; (б) – отримання драйверної лінії, для активації конструкту у гліальних клітинах.

Стандартним способом згодовування експериментальних засобів та речовин в дослідженнях на дрозофілі є личинкове згодовування [10]. Оскільки, ми досліджували характеристики нейродегенерації, що властива старіючому організму, то оцінювали фенотип старих 21-денних особин.

Ми провели аналіз гістологічних зрізів тканини мозку 21-денних самців трансгенних особин та контрольних особин Repo-Gal4/ +, які споживали експериментальний препарат М-2 та вирощувалися без нього.

При аналізі фенотипу тканини мозку мух з генотипом Repo-Gal4/UAS- Sod1-RNAi із функціональним нокаутом гена sws у гліоцитах було виявлено специфічний фенотип. А саме, в ділянці, що відповідає переходу ламіни у ретину та медулу, де найбільша концентрація гліоцитів, виявлено значну вакуолізацію тканини мозку (рис. 7). У контрольних особин з генотипом Repo-Gal4/ + спостерігалася суцільна структура тканини у цій ділянці мозку.

У контрольних особин Repo-Gal4/ + після вживання М-2 не виявлено фенотипових змін тканини мозку. У дослідних особин Repo-Gal4/UAS- Sod1-RNAi після споживання засобу М-2 зберігалися патологічні зміни у тканині мозку аналогічні тим, що були у нелікованих мух.

Оскільки помітних візуальних змін при аналізі тканини мозку не виявлено, необхідно було зробити кількісний аналіз нейродегенеративних зон. Ми обрахували площу вакуолей, аналізуючи мікрофотографії за допомогою графічного редактора Kompas 13 portable mini. Було з’ясовано, що середня площа вакуолей 21-денних особин вирощених на стандартному середовищі, складала 141,521±12,36 мм², після личинкового згодовування М-2 площа вакуолей зменшилася та становила 106,81±14,17* мм², що є достовірною відмінністю (табл. 1).

Таблиця 1

Умовна площа зон дегенерації у тканині мозку особин D. melanogaster із функціональним нокаутом гена Sod1 у гліальних клітинах в контролі та після згодовування препарату М−2

ГЕНОТИП N=10	Площа зон дегенерації, мм^2 21- денні особини
K (M±m)	+M−2 (M±m)
Repo-Gal4/+
UAS-Sod1-RNAi/Repo-Gal4	141,521±12,36	106,81±14,17*

а)

б)

Рис. 7. Гістологічні зрізи мозку: а) контрольних особин Repo-Gal4/ +;

б) особин із функціональним нокаутом гена Sod1 UAS-Sod1-RNAi/Repo-Gal4 (збільшення15×40)

Встановлено, що засіб М-2 містить у своєму складі компоненти, які здатні чинити нейрпротекторний ефект на клітини мозку старих особин дрозофіли за умови личинкового згодовування.

У трансгенних особин з дисфункцією гена Sod1, які споживали препарат, спостерігається зменшення зон дегенерації у мозку дрозофіли.

4. ОХОРОНА ПРАЦІ І БЕЗПЕКА В НАДЗВИЧАЙНИХ СИТУАЦІЯХ

4.1. Аналіз стану виробничих умов

4.1.1. Характеристика лабораторії

Експериментальна частина дипломної роботи проводилася в науково-дослідній лабораторії генетики та біохімії дрозофіли № 143 на кафедрі генетики та біотехнології біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка, що розташована на першому поверсі та складається з однієї кімнати загальною площею 16м². Приміщення лабораторії повністю відповідає вимогам діючих методик, санітарним нормам, вимогам безпеки праці та протипожежної безпеки.

Вікно 1,3×2,2 м² забезпечує природне освітлення лабораторії. Штучне освітлення представлене 6-ма лампами денного світла та настільними лампами, кожна потужністю 100Вт. Лабораторія обладнана водогінною, газопровідною системами та електричною мережею 220В. підлога має лінолеумне покриття. Вентиляція механічна, джерел пилоутворення немає. В лабораторії наявні інструкції по техніці безпеки з усіма наявними приладами, а також інструкції з пожежної безпеки та план евакуації на випадок виникнення пожежі. В приміщенні лабораторії щоденно проводиться вологе прибирання згідно з санітарно-гігієнічними вимогами. Всі працівники забезпечені необхідними засобами індивідуального захисту – халатами, одноразовими рукавичками, а також медичними препаратами для надання невідкладної медичної допомоги.

4.1.2. Аналіз методів дослідження і характеристика обладнання

У постановці дослідів використовували такі методи:

v постановка мух на старіння;

v побудова кривих виживання;

v підготовка предметних скелець;

v фіксація мух та виготовлення постійних препаратів зрізів головного мозкку;

v визначення чутливості до умов оксидативного стресу нейродегенеративних мутантів та мух дикого типу;

v приготування гомогенатів;

v визначення кількості білку за методом Лоурі;

v визначення вмісту ТБК-позитивних продуктів у нейродегенеративних мутантів та мух дикого типу;

v визначення вмісту діє нових коньюгатів у нейродегенеративних мутантів та мух дикого типу;

v статистична обробка результатів.

Для здійснення дослідницької роботи за цими методиками використовували таке обладнання: аналітична вага, бінокуляр МБС-10, світловий мікроскоп Carl Zeiss Jena, центрифуга К23D, спектрофотометр СФ-16, сушильна шафа 2В-151, термостати на 25^оС та 29^оС.

· Аналітична вага – призначена для зважування мікроскопічних кількостей реактивів. Небезпечним при користуванні аналітичними вагами є контакт тіла людини з частинами приладу, що можуть опинитися під напругою.

· Бінокуляр – призначений для спостереження об’ємних предметів. Робота з його використанням може проводитись за умов штучного та природного освітлення. Живлення лампи освітлювача здійснюється через блок живлення від джерела змінного струму напругою 220В. небезпеку може становити порушення електроізоляції та створення в лабораторії електронебезпечних умов, а саме підвищена вологість та запиленість.

· Світловий мікроскоп – для звичайних мікроскопічних досліджень. Електрообладнання розраховано на пряме ввімкнення в мережу змінного струму напругою 220В. Освітлювач, що вбудовано в передню частину основи штативу, складається з галогенної лампи накалювання. Небезпека може полягати в небажаному контакті з механічними частинами при порушенні ізоляції та порушенні правильного освітлення, яке часом може призводити до порушень зору.

· Центрифуга – потрібна для відокремлення клітин від культуральної рідини. При недостатній ізоляції проводів та при відсутності заземлення можуть виникнути електротравми. Винятковим явищем є розрив центрифуги, самовільне відкривання кришки приладу, яке може трапитися при не зрівноваженні центрифуги.

· Спектрофотометр – прилад, що використовується для визначення оптичної густини розчинів при певній довжині хвилі. При недостатній ізоляції проводів та при відсутності заземлення можуть виникнути електротравми.

· Сушильна шафа – використовується для сушки лабораторного посуду. Прилад вмикається в мережу 220В. небезпечним при роботі з термостатом є контакт тіла людини з частинами приладу, що можуть опинитись під напругою або отримання опіків ділянок шкіри при дотику до гарячого скла чи внутрішніх частин приладу, нагрітих вище 100^оС.

· Електричний термостат – призначений для досліджень при підвищеній температурі (20^оС - 50^оС). вмикається в звичайну електромережу з напругою 220В. небезпечним при роботі з термостатом є контакт тіла людини з частинами приладу, що перебувають під напругою.

Для оформлення результатів досліджень використовувався персональний комп’ютер.

Правила техніки безпеки і вимоги перед початком роботи з ПК:

До роботи на засобах обчислювальної техніки та ПЕОМ допускаються особи, що вивчили інструкцію по експлуатації складових частин чи пристроїв, що входять в склад ПЕОМ. Перевірити комплектність складових частин ПЕОМ. При виявленні недоліків повідомити обслуговуючий персонал (ст. лаборанта, зав. лабораторією). Всі засоби подачі напруги живлення від загальної електромережі повинні бути виключеними [9]. Перед початком роботи на ПЕОМ і включенням напруги живлення від загальної електромережі, а також включених складових частин ПЕОМ всі особи, які знаходяться в лабораторії повинні знаходитись на своїх робочих місцях. Подача джерела живлення на розетки загальної електромережі та включення пристроїв ПЕОМ тільки з дозволу викладача або лаборанта. Тривалість безперервної роботи з ПЕОМ без регламентованих перерв не повинна перевищувати 2 години. Під час регламентованих перерв з метою зниження нервово-емоційного напруження, втоми зорового аналізатора, усунення впливу гіподинамії і гіпокінезії, попередження розвитку втоми доцільно виконувати комплекси спеціальних фізичних вправ. Перед початком роботи оператор зобов’язаний оглянути і привести до порядку робоче місце, відрегулювати робоче освітлення, перевірити правильність приєднання обладнання до електромережі, переконатися в наявності захисного заземлення та приєднання екранного провідника до корпусу процесора, переконатися у відсутності дискет в дисководах процесора ПЕОМ. Оператор під час роботи зобов’язаний утримувати в порядку і чистоті робоче місце, дотримуватись санітарних норм та режиму роботи і відпочинку, а також правил експлуатації ПЕОМ відповідно до інструкції з експлуатації, дотримуватися відстані від очей до екрану в межах 60-80 см. Одним з рекомендованих режимів є: 40-45 хвилин роботи з ПЕОМ та 15-20 хвилин перерви.

Забороняється відключати або включати складові частини ПЕОМ в розетки загальної електромережі на робочих місцях без дозволу викладача, лаборанта, зав. лабораторією. Переставляти складові частини ПЕОМ та їх підключати. Працювати на ПЕОМ, якщо пошкоджений шнур чи розетка. Перевіряти чи міняти запобіжники на складових частинах ПЕОМ. Використовувати складові частини ПЕОМ, якщо на них попала вода або пролита рідина, блокувати вентиляційні отвори на кришках складових частин ПЕОМ. Розміщувати шнур живлення там, де по ньому можуть проходити люди. проштовхувати предмети через бокові отвори, що може призвести до короткого замикання. Залишати включеними пристрої ПЕОМ і виходити з лабораторії без дозволу викладача або лаборанта. По закінченню роботи оператор зобов’язаний закрити всі активні завдання, переконатися, що в дисководах немає дискет, вимкнути живлення системного блоку і всіх периферійних пристроїв, вимкнути блок живлення. У будь яких випадках збоїв у роботі технічного обладнання чи програмного забезпечення негайно викликати представника інженерно-технічної служби експлуатації обчислювальної техніки.

Небезпечними і шкідливими виробничими факторами при виконанні робіт на ПЕОМ є підвищення рівня електромагнітного, рентгенівського, ультрафіолетового, інфрачервоного випромінювання, статичної електрики, підвищена яскравість світлового зображення, підвищений рівень пульсації світлового потоку, а також ряд інших хімічних та психофізичних чинників.

4.1.3. Характеристика об’єкту досліджень, речовин та їх небезпечних властивостей

В даній роботі об’єктом дослідження виступали лінії нейродегенеративних мутантів плодової мушки D.melanogaster по 3-й хромосомі та лінія дикого типу в якості контролю.

Небезпеку для здоров’я несе робота робота з хімічними речовинами. Вони можуть бути отруйними, викликати опіки, а також бути причиною пожежі при неправильному користуванні [10, 11].

Органічні речовини, які використовуються в лабораторії, поділяються на 4 групи:

· Група 1 – речовини, що дають гострі отруєння, часто мають дію наркозу. Максимально допустима концентрація (МДК) – 0,2 мг/л (спирти: етанол, пропанол, бутанол; діетиловий ефір; ацетон).

· Група 2 – більш токсичні речовини: метанол, діоксан, дихлоретат. При цьому, разом з явищами наркозу, викликаються зміни в різни х органах. МДК – 0,05 мг/л.

· Група 3 – розчинники, для яких характерна велика токсичність: бензол, толуол.

· Група 4 – особливо шкідливі речовини, які дають тяжкі і смертельні отруєння (метилвіологен).

Поряд з гострими отруєннями можуть бути викликані хронічні зміни в нервовій і кровоносній системах. МДК – 0,01 мг/л.

У процесі досліджень використовувались такі хімічні речовини:

· Діетиловий ефір – жовтувата рідина з різким специфічним запахом. Є сильно леткою і легкозаймистою речовиною. Всі роботи проводяться під витяжною шафою. При вдиханні ефір має легкий наркотичний ефект. ГДК – 300 мг/м³.

· Етиловий спирт – вибухонебезпечна речовина, температура кипіння 78^оС. ГДК – 1000 мг/м³. Наркотична речовина, викликає сильне збудження, а згодом – параліч ЦНС. Смертельна доза – 200 – 300 мл. При ураженні шкіри настає сухість і зявляються тріщини.

· Оцтова кислота – безбарвна рідина з характерним запахом, відноситься до речовин 3-го класу небезпеки. ГДК – 5 мг/м³. Вогненебезпечна при контакті з нітратною кислотою, хромовим ангідридом і пероксидом водню. Викликає опіки шкіри, пошкоджує слизові оболонки верхніх дихальних шляхів та очей.

· Хлороформ – рідка прозора речовина зі специфічним запахом. Летка та легкозаймиста, всі роботи проводяться під витяжною шафою. При вдиханні може викликати от труєння та запалення слизових верхніх дихальних шляхів.

· Хромова суміш – високореакційноздатна речовина. При попаданні на шкіру і слизові оболонки викликає великі опіки, негативно впливає на ЦНС.

· Метилвіологен – порошкоподібна речовина блідо-жовтого кольору без запаху. Дуже токсична, всі роботи проводяться під витяжною шафою з використанням засобів особистої безпеки. Відноситься до 4 класу небезпеки. Летальна доза 35мг/кг. При вдиханні може викликати гострий респіраторний синдром, при потраплянні в організм летальність у більшості випадків.

Дата добавления: 2015-07-13