Виробництво незамінних амінокислот

Амінокислоти з кожним роком знаходять все більше застосування як кормові і харчові добавки та приправи, сировина фармацевтичної і парфумерної промисловості. Всі амінокислоти, з яких складаються білки, є L-формами. Із 20 амінокислот − 8 (ізолейцин, лейцин, лізин, метионін, треонін, триптофан, валін, фенілаланін) незамінні для людини. Для сільськогосподарських тварин цей список доповнюють гістидин і аргінін, а для молодняку птиці – ще і пролін. Тому у великих кількостях амінокислоти використовують для балансування кормів. Введення до складу комбікормів амінокислот скорочує витрати дефіцитних білків тваринного походження. За останніх 10 років кількість амінокислот, що використовуються в кормовиробництві, зросла в 15 разів. Це майже 70% від обсягу їх виробництва. До 30% вироблюваних амінокислот використовується в харчовій промисловості. Так, цистеїн запобігає пригоранню їжі в процесі приготування, поліпшує якість хліба при випічці, посилює запах їжі. Гліцин, що має освіжаючий, солодкуватий смак, використовується за виробництва напоїв. Глютамінова кислота − для посилення смаку і консервування їжі. Ряд амінокислот (аргінін, аспартат, цистеїн, фенілаланін та ін.) використовують у медицині, в хімічній і фармацевтичній промисловості як попередники для виробництва поліамінокислот, поліуретану і препаратів для сільського господарства.

Отримання амінокислот можливе декількома шляхами: хімічним синтезом, гідролізом природної білкової сировини і в біотехнологічних процесах. Хімічний синтез дає рацемат − продукт, що містить як L-, так і D-форми амінокислот. За винятком гліцину, який не має оптично активних ізомерів, і метіоніну, засвоєного організмами в обох формах, D-ізомери володіють токсичністю. Отримання оптично активних L-ізомерів амінокислот із гідролізатів природних матеріалів рослинного і тваринного походження пов'язане з багатоступінчастим і дорогим очищенням. Біотехнологічне отримання амінокислот включає пряму мікробну ферментацію, а також мікробіологічний або ферментативний синтез із попередників.

Мікробіологічний метод отримання амінокислот, найбільш поширений в даний час, заснований на здатності мікроорганізмів синтезувати всі L-амінокислоти, а в певних умовах − забезпечувати їх надсинтез. Біосинтез амінокислот у мікробних клітинах відбувається у вигляді так званих вільних амінокислот або пулу амінокислот, з якого в процесах конструктивного метаболізму синтезуються клітинні макромолекули. Для синтезу всіх білків необхідно 20 амінокислот. Шляхи синтезу більшості амінокислот взаємопов'язані. При цьому одні амінокислоти є попередниками для біосинтезу інших. Піруват є попередником аланіну, валіну, лейцину; 3-фосфогліцерат-серіну, гліцину, цистеїну; щавлево-оцтова кислота − аспартату, аспарагіну, метіоніну, лізину, треоніну, ізолейцину; а-кетоглутарова кислота − глутамату, глутаміну, аргініну, проліну; фосфоенолпіруват + еритрозо-4-фосфат − фенілаланіну, тирозину, триптофану; 5-фосфорибозіл-1-пірофосфат + АТФ − гістидину. Синтез кожної амінокислоти в мікробних клітинах перебуває під суворим генетичним контролем і реалізується в чітко визначених кількостях, що забезпечує утворення наступних амінокислот. Контроль здійснюється за принципом зворотного зв'язку на рівні генів, відповідальних за синтез певних ферментів (репресія), і на рівні самих ферментів, які внаслідок надлишку амінокислот, що утворюються, можуть змінювати свою активність (ретроінгібування). Даний механізм контролю виключає надвиробництво амінокислот і також перешкоджає їх виділенню з клітин у навколишнє середовище. Щоб досягти надсинтезу окремих амінокислот, необхідно обійти або змінити даний контрольний меканізм їх синтезу. Для першого шляху можливе використання природних диких штамів; дуже суттєві при цьому умови ферментації, оскільки досягти дисбалансу в системі синтезу амінокислот можливо шляхом зміни ряду основних факторів середовища (концентрація основного субстрату, рН, співвідношення макро- і мікроелементів у середовищі та ін.). Зміна контрольного механізму синтезу амінокислот здійснюється генетичними методами. При цьому отримують організми мутанти: ауксотрофи і регуляторні (конститутивні) мутанти. Ауксотрофні мутанти − це організми, що втратили здатність до синтезу однієї або декількох амінокислот.

Серед продуцентів амінокислот − різні мікроорганізми, представники родів Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter, Microbacterium, Eschirichia. Використовувані в промисловості мікроорганізми можна підрозділити на декілька класів: дикі штами, ауксотрофні мутанти, конститутивні мутанти і ауксотрофні конститутивні мутанти. Промислові штами, як правило, несуть декілька мутацій, що торкаються механізмів регуляції цільової амінокислоти та її попередників.

Для отримання таких амінокислот, як L-глутамату, L-валіну, L-аланіну, L-глутаміну і L-проліну можливе застосування природних штамів і посилення в них продукції амінокислот умовами ферментації. Синтез L-глутамата можна переключати на утворення L-глутаміну або L-проліну, змінюючи умови ферментації. За підвищення концентрації йонів амонію і біотину в середовищі стимулюється утворення L-проліну; слабкокисле середовище та йони цинку за надлишку амонію посилюють синтез L-глутаміну.

Ауксотрофні мутанти використовують у разі, коли необхідно синтезувати амінокислоти, що є кінцевими продуктами розгалужених ланцюгів метаболічних реакцій амінокислот. Наприклад, для отримання L-лізину, L-треоніну, L-метіоніну або L-ізолейцину, для яких загальним попередником є L-аспартат, застосовують мутанти, ауксотрофні за гомосеріном або треоніном і гомосеріном. Ауксотрофні мутанти не здатні утворювати інгібітори відповідного метаболічного шляху, що працюють за принципом негативного зворотного зв'язку через відсутність певної ключової ферментативної реакції. Тому за вирощування такого штаму в середовищі з мінімальною концентрацією необхідного інгредієнта (амінокислоти) вони здатні на суперпродукцію амінокислоти-попередника. Ауксотрофні мутанти, що здатні накопичувати кінцеві продукти нерозгалужених ланцюгів біосинтезу, наприклад L-аргініну, неможливі. У даній ситуації доводиться одержувати мутанти з частково порушеною регуляцією біосинтезу, оскільки це дозволяє підвищити вихід цільового продукту. Такі організми є регуляторними мутантами.

Регуляторних мутантів відбирають за стійкістю до аналогів амінокислот або серед ревертантів ауксотрофів. Аналоги амінокислот виступають в ролі штучних інгібіторів ферментів, що працюють за принципом зворотного зв'язку, одночасно забезпечуючи біосинтез необхідних амінокислот і пригнічуючи процес їх введення в білки. Регуляторні мутанти отримують шляхом трансдукції, проводячи при цьому відбір спочатку окремих мутацій, що викликають повне розузгодження механізмів регуляції, а потім об'єднуючи дані ознаки шляхом котрансдукції. Внаслідок цього, в одному штамі можливо послідовно закріпити стійкість до декількох аналогів.

Останніми роками для отримання нових ефективних штамів-продуцентів амінокислот почали застосовувати новітні методи біотехнології. Методи генетичної інженерії дозволяють підвищувати кількість генів біосинтезу шляхом їх клонування у плазмідах. Це приводить до збільшення кількості ферментів, відповідальних за синтез амінокислот, отже, підвищує вихід цільового продукту. Клонування генів системи синтезу амінокислот у клітинах мікроорганізмів з іншим, порівняно з донорським організмом, типом живлення дозволяє розширювати сировинну базу і замінювати дорогі цукровмісні субстрати дешевшими.

Виробничі біотехнологічні процеси отримання амінокислот реалізуються в умовах глибинної періодичної аеробної ферментації. Максимальна продукція амінокислоти настає, як правило, коли приріст біомаси практично припиняється. Тому поживне середовище на першому етапі ферментації повинно забезпечувати збалансований ріст клітин, а на другому − умови для надсинтезу цільової амінокислоти. Як джерело вуглецю і енергії використовують багаті цукровмісні субстрати, головним чином, мелясу. Можливе також залучення доступніших субстратів (ацетат, сульфітний луг, вуглеводні). Залежно від фізіологічних потреб мікроорганізмів як джерело азоту використовують солі амонію, нітрати, а також амінокислоти і молекулярний азот. До складу середовища вносять необхідну кількість вуглецю і азоту, фосфатів та інших солей, а також стимулятори росту (вітаміни, дріжджовий екстракт), ПАР, антибіотики. Періодичний режим ферментації і багате за складом середовище потребують дотримання суворої стерильності під час отримання інокуляту. і на стадії ферментації. Стерилізації піддаються поживне середовище, повітря і все технологічне обладнання. Після стадії ферментації" в процесі обробки культуральної рідини клітини відокремлюють від розчину, який далі піддають очищенню від забарвлених домішок і зважених часток за допомогою сорбційних методів. Далі процес проводиться з використанням різних методів виділення і очищення залежно від сфери застосування кінцевого продукту. Для фармакології і харчової промисловості амінокислоти випускають у вигляді висушених чистих кристалічних препаратів; для кормових і технічних цілей − використовують стабілізовану і сконцентровану культуральну рідину.

Технологія отримання глютамінової кислоти. L-глютамінова кислота − перша амінокислота, отримана на основі промислового мікробіологічного синтезу. Вона є найважливішою амінокислотою рослинних і тваринних білків, не будучи незамінною. Можливість отримання глютамінової кислоти з вуглеводів на основі мікроорганізмів уперше було продемонстровано в 1957 р. японськими дослідниками М. Кіносита, С. Асаї та ін. Продукувати глютамінову кислоту здатні дріжджі, мікроскопічні гриби, бактерії. Бактерії забезпечують найбільший вихід по відношенню до використаного вуглецевого субстрату (не менше 40... 50%). Промислове значення мають бактеріальні культури (Micrococcus, Brevibacterium, Microbacterium, Corynebacterium). Надсинтез кислоти у диких штамів можливий у спеціальних фізіологічних умовах за гальмування швидкості росту і збільшення проникності клітинної мембрани для глютамінової кислоти. Такі умови забезпечує певна концентрація біотину в середовищі (1...5 мкг/л), а також наявність деяких антибіотиків. Внутріклітинна концентрація глютамінової кислоти знижується внаслідок екскреції продукту в навколо клітинне середовище, тому регуляція синтезу кінцевим продуктом слабшає. Надпродукція глютамінової кислоти пов'язана також з високою концентрацією амонію в середовищі.

Глютамінова кислота в основному використовується у фармакології і харчовій промисловості, тому завдання стадії постферментації − отримання високоочищених препаратів.

Глютамат натрію посилює смак багатьох харчових продуктів, сприяє тривалому збереженню смакових якостей консервованих продуктів (овочів, риби, м'ясних продуктів). За кордоном глютамат натрію додають у всі продукти не лише при консервуванні, а при заморожуванні та просто зберіганні. У Японії, СІЛА й інших країнах глютамат натрію є обов'язковою належністю столу аналогічно солі, перцю, гірчиці. Глютамінова кислота не лише підвищує смакову цінність їжі, а й стимулює травлення. Важливі властивості глютамінової кислоти − бути захисним фактором при отруєннях внутрішніх органів (печінки, нирок), послаблювати дію токсинів і підсилювати ряд фармакологічних препаратів. У даний час виробництво глютамінової кислоти є великотоннажним біотехнологічним виробництвом (близько 400000 т/рік). Обсяги її виробництва зростають з кожним роком. Провідними країнами − виробниками глютамінової кислоти і глютамату натрію є Японія і США.

Технологія отримання лізину. L-лізин в організмі вищих тварин і людини визначає біологічну цінність перетравного білка. Дана амінокислота виконує також багато інших найважливіших біохімічних функцій − сприяє секреції травних ферментів і транспортуванню кальцію в клітини, поліпшує загальний азотний баланс в організмі. Додавання лізину до складу комбікормів збільшує засвоюваність білка тваринами і знижує витрату кормів на виробництво тваринницької продукції.

Синтез L-лізину в мікроорганізмах здійснюється різними шляхами. Дріжджі, гриби і мікроводорості синтезують лізин з -кетоглутарової кислоти. Вищі рослини і бактерії синтезують лізин за іншою схемою − через а-діамінопімелінову кислоту. За цією розгалуженою схемою біосинтезу L-лізину синтез починається з аспарагінової кислоти. Окрім L-лізину, аспарагінова кислота є також попередником для L-метіоніну, L-треоніну і L-ізолейцину. Продукти обміну, що пригнічують різні ферменти і беруть участь у синтезі лізину, слід вивести з реакції. Саме тому для виробництва L-лізину використовують різні ауксотрофні мутанти. Отримано штами, що забезпечують 40% конверсію вуглецевого субстрату в амінокислоту і виходи лізину на цукрах до 40, оцтовій кислоті − до 70 г/л.

Мікробіологічний процес виробництва лізину аналогічний схемі отримання глютамінової кислоти. Проте використання ауксотрофних мікроорганізмів потребує спеціального складу поживного середовища, яке підбирається індивідуально для кожного штаму. Кінцева концентрація кислоти досягає 40 г/л за залишкової концентрації цукрів близько 0,5... 1,0 г/л. Ефективний процес отримання лізину реалізований на доступнішому субстраті – оцтовій кислоті. Кінцева концентрація лізину в середовищі досягає 40...50 г/л. Останніми роками отримано штами мутантів В. flavum, що забезпечують на ацетатному середовищі вихід лізину до 73 г/л.

Практично весь вироблюваний мікробіологічним способом L-лізин використовується в кормовиробництві для підвищення засвоюваності і поживності кормів. Тому випускається лізин, головним чином, у вигляді кормових препаратів − рідкого концентрату лізину (РКЛ) і кормового концентрату лізину (ККЛ).

ККЛ отримують на основі РКЛ, висушуючи рідкий концентрат у розпилювальних сушильнях за температури не більше 90°С до залишкової вологості 4...8%. Препарат за складом близький до рідкого концентрату лізину і містить (у %): 7... 10 лізину, 15... 17 білка, до 14 інших амінокислот, 10... 13 бетаїну і 20...25 зольних речовин. Препарат сипкий і негігроскопічний. Термін його зберігання збільшується до 1 року.

Технологія отримання триптофану. L-триптофан – відноситься до незамінних амінокислот. Триптофан, поряд з іншими ароматичними амінокислотами, фенілаланіном і тирозином, останніми роками знаходить усе більше застосування. Відсутність або дефіцит триптофану в організмі призводить до ряду важких захворювань (діабет, туберкульоз, пелагра).

Мікробіологічний синтез L-триптофану здійснюють на основі штамів мутантів дріжджів (Candida) і бактерій (Е. coli, Bacillus subtilis), дефіцитних за тирозином і фенілаланіном. Промисловий синтез L-триптофану здійснюється на основі цукрів. Для отримання очищеного кристалічного препарату працюють з культуральною рідиною. Для отримання кормового концентрату використовують і біомасу клітин.

Дата добавления: 2017-02-01