Построение калибровочного графика.

Ход работы

Исследуемый материал и реактивы

Лабораторная работа №31

Определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом (набором реагентов)

При удалении форменных элементов из крови остается плазма, а при извлечении из нее фибриногена – сыворотка крови. Общее количество белков в плазме составляет 70-85 г/л. С возрастом количество белков в плазме крови уменьшается до 65-67 г/л. Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови у взрослых 65-85 г/л, у детей до 6 лет – 56-86 г/л.

Основными группами белков плазмы являются альбумины (54-65 г/л), глобулины (34-46 г/л) и фибрин (2-4 г/л). С помощью электрофореза можно разделить их на несколько фракций: преальбумины, альбумины (от3 до 5 фракций), глобулины (от 5 и более фракций). Глобулины составляют в среднем 36,8 % общего количества белков сыворотки крови, в том числе: α₁-глобул 2-5%, α₂-глобулины – 7-13%, β-глобулинов – 8-15%, γ-глобулинов – 12-22%. Большинство белков находится в плазме в виде комплексов (липопротеины, гликопротеины и др.).

Белки крови выполняют разнообразные функции: дыхательная, транспортная, поддерживают осмотическое и онкотическое, обладают антигенной активностью.

Принцип метода: пептидные связи белков образуют в щелочной среде с ионами двухвалентной меди комплекс сине-фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации белка и измеряется фотометрически.

1. Сыворотка крови. 2. Биуретовый реактив. 3. Стандартный раствор белка. () Тимоловый реактив. 4. Раствор хлорида натрия (0,9%).

Внести в пробирки реагенты в соответствии со схемой:

Реагенты	Опытная проба (мл)	Калибровочная проба (мл)	Контрольная проба (мл)
0,9: р-р NaCl	0,45	0,45	0,50
Сыворотка	0,05	–	–
Стандарт	–	0,05	–
Биуретовый реактив	2,00	2,00	2,00

Содержимое пробирок перемешать, избегая образования пены. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре (18-25⁰С).

После инкубации измерить экстинкцию опытных проб против контрольной пробы в кювете с длиной оптического пути 10мм при длине волны 540 нм (500-560 нм).

Концентрацию общего белка рассчитывают по формуле:

где С – концентрация общего белка, г/л; Е_О – экстинкция опытной пробы; Е_СТ – экстинкция стандартного раствора белка; А – концентрация белка в стандарте, г/л.

или определяют по калибровочному графику.

Из стандартного раствора белка готовят калибровочные растворы в соответствии с таблицей:

№ п/п	Стандартный р-р белка, мл	0,9% р-р NaCl	Концентрация белка, г/л
	0,1	0,4	0,2хА
	0,2	0,3	0,4хА
	0,3	0,2	0,6хА
	0,4	0,1	0,8хА
	0,5	–	1,0хА

Примечание. А – концентрация белка в стандарте, г/л.

0,5 мл каждого калибровочного раствора вносят в пробирки с 0,45 мл 0,9% раствора NaCl, добавляют по 0,2 мл биуретового реактива. Перемешивают и через 30 минут фотометрируют против контрольной пробы (см. ход определения). По полученным данным строят калибровочный график или рассчитывают фактор пересчета.

Дата добавления: 2017-02-01