Створення і скринінг геномних бібліотек

Мета біотехнологічних експериментів часто полягає в ідентифікації генів, які кодують певні білки (структурних генів). Оскільки у прокаріот кодуючі домени (ділянки) структурних генів безперервні, а в еукаріот кодуючі частини (екзони) розділені не кодуючими (інтронами), то за їх клонування використовуються різні методи. У прокаріот сумарну ДНК гідролізують рестриктазою і кожен з отриманих фрагментів вбудовують у вектор. Потім необхідно виявити специфічну лінію клітин (клон), що містить необхідну послідовність, відділити її і охарактеризувати. Процес розподілення геномної ДНК на елементи для клонування, введення цих елементів до клітин-господарів має назву створення геномної бібліотеки. Повна бібліотека містить весь геном даного організму.

Один із способів створення бібліотеки ДНК полягає в обробці донорської ДНК рестриктазою в умовах, коли відбувається лише часткове розщеплення таким чином, що створюються фрагментирізних розмірів. Частковий гідроліз дозволяє клонувати цілі гени, однак, оскільки сайти рестрикції розташовані не випадково, деякі фрагменти можуть виявитися занадто великими для клонування. Для вирішення цієї проблеми використовують іншу додаткову рестриктазу.

Фрагменти, що отримані, з'єднують з ДНК векторів за допомогою лігази і, за можливістю, упаковують у підготовлені головки фагових часточок. Бібліотеку зберігають у вигляді фагового банку під хлороформом за температури -70°С. Таким чином бібліотека здатна зберігатися десятки років. Ампліфікацію бібліотеки (розмноження) геномних клонів, що отримано, а також розшук необхідного клону проводять при зараженні фагової бібліотекою бактеріальні клітини, які у подальшому висівають на чашках Петрі з агаризованим середовищем. Повний гаплоїдний набір клітин ссавців містить близько 3 х 10⁹ пар основ. За ємністю вектора 15 т.п.н. бібліотека може містити до 1 млн. фагових часточок. Перевірка мільйона фагових бляшок дозволяє перевірити весь геном на наявність необхідного гена. Так можна ідентифікувати напевно ті фагові часточки, що містять послідовність дослідженого гена, розмножити ДНК цієї послідовності й проводити з нею подальші маніпуляції.

Наступний після створення бібліотеки етап − це розшук клону (клонів), що містять необхідну послідовність ДНК. Для цього використовують три методи: гібридизацію з міченим ДНК-зондом з наступним радіоавтографічним аналізом; імунологічний скринінг (ідентифікація одиничного об'єкта шляхом перевірки чисельних об'єктів); скринінг за ефектом активності білка, що кодується геном -мішенню.

Скринінг за допомогою гібридизації. Необхідну нуклеотидну послідовність у зразку ДНК можна виявити за допомогою ДНК-зонду, який з'єднується лише з послідовністю, що розшукується.

ДНК-гібридизація полягає в тому, що ДНК-мішень піддають денатурації (роз'єднанню ланцюгів ДНК під дією теплової обробки або впливу лугів) і одноланцюгові молекули міцно приєднують до твердої підложки (нітроцелюлозного або нейлонового фільтра). Потім фільтр інкубують з одноланцюговим ДНК-зондом, що позначений радіоізотопами або іншими мітками. Якщо нуклеотидні послідовності зонду і ДНК-мішені комплементарні, то відбувається їх спаровування (тобто гібридизація). Гібридні молекули можна виявитирадіографічним або іншими методами (рис. 28). Для гібридизації необхідно, щоб на ділянці завдовжки 50 нуклеотидів збігалося понад 80% з них.

Мічені ДНК-зонди для скринінгу бібліотеки можна отримати щонайменше двома способами. По-перше, можна використовувати клоновану ДНК близькоспорідненого організму (гетеролітичний зонд). По-друге, зонд можна отримати методом хімічного синтезу, що заснований на відомій амінокислотній послідовності білкового продукту гена, що розшукується.

Рис. 28. Схема проведення скринінгу методом гібридизації

Імунологічний скринінг. За відсутності ДНК-зонду можна використовувати інші методи, наприклад, якщо клонований ген здатний до експресії (реалізації генетичної інформації), то його продукт − весь білок або його частину − можна виявити за імунологічними методами. Всі клітинні лінії (клони) бібліотеки висівають на чашки з поживним середовищем. Колонії, що виросли, переносять на фільтр, клітини лізирують (руйнують), а білки, що звільнилися, фіксують на фільтрі. Далі на фільтр наносять перші антитіла, які специфічно зв'язуються з певним білком (антигеном), усі антитіла, що не зв'язалися − віддаляють, а фільтр поміщають у розчин других антитіл, специфічних до перших антитіл. Часто використовують кон'югати інших антитіл з ферментом, під впливом якого відбувається гідроліз субстрату з утворенням забарвленої речовини в тому місці, де здійснюється реакція.

Скринінг за активністю білка. У разі, коли ген, що розшукується, кодує фермент, який не синтезується клітиною-власником, використовують метод ідентифікації на чашках. Для виявлення клонів, які містять цей ген, клони Е. соli, що складають геномну бібліотеку даного організму (клітини-власника), висівають на середовищі із специфічним субстратом. Клітини, що здатні утилізувати цей субстрат, після фарбування набувають певного забарвлення.

Якщо ген, що розшукується, кодує продукт, без якого клітина-власник не здатна рости на мінімальному середовищі, то бібліотеку можна створювати методом трансформації мутантних клітин. Клони, що не містять цей ген, будуть гинути, а на мінімальному поживному середовищі залишаться лише клітини, до складу яких увійшов необхідний ген.

Блот-гібридизація. За створення клонотек генів хромосомну ДНК розрізають на фрагменти за допомогою рестриктаз. При цьому невідомо, чи містить ген, що розшукується, сайт або сайти розщеплення певної рестриктази. Якщо такі сайти є, то виділити цілий ген не вдається, і тому треба використовувати іншу рестриктазу. Однак, ще попередньо, без клонування у бактеріях, можна досліджувати структуру індивідуальних генів, визначити в них наявність тих чи інших сайтів рестрикції, встановити число копій даного гена у геномі. Метод блот-гібридизації, що використовується для цього, потребує наявності відповідної мРНК або кДНК.

Аналіз здійснюютьтаким чином (рис. 29). Високомолекулярну хромосомну ДНК розщеплюють рестриктазою або їх набором, фрагменти, що створилися, розподіляють за довжиною електрофорезом в агарозному* гелі, і гель поміщають на лист нітроцелюлози. Після цього напрям електрофорезу змінюють перпендикулярно (у напрямку листа). При цьому ДНК з гелю переходить на нітроцелюлозу і створюється репліка із гелю. Надалі здійснюють гібридизацію на фільтрі фрагментів хромосомної ДНК із зондом. Зонд гібридизується лише з тими фрагментами (смугами), що містять відповідний до нього ген. Смуги, у яких зв'язалася мітка, виявляють радіографією.

Наявність на автографі однієї смуги свідчить про те, що під час рестрикції ген не розщеплюється, а інтенсивність смуги дає можливість визначити кількість копій гена у геномі.

Аналогічний метод розроблено для аналізу клітинних мРНК з метою з'ясування їх повної або часткової відповідності зонду, а також для визначення їх числа. Метод є корисним доповненням до техніки клонування ДНК, оскільки дозволяє визначити ступінь відповідності специфічної ДНК зонду.

Для клонування еукаріотичних структурних генів необхідні спеціальні методики. Прокаріоти не здатні видаляти інтрони з первинних РНК-транскриптів, тому правильна трансляція еукаріотичних мРНК у бактеріальній клітині неможлива. Більш того, експресія еукаріотичної ДНК може здійснюватися лише за наявності прокаріотичних сигнальних послідовностей, що регулюють транскрипцію й трансляцію. Кінцеві ділянки еукаріотичних мРНК особливим чином модифіковані: їх 5'-кінці кепіровані (містять «кеп» із залишку G, часто метильованого), а 3'-кінці поліаденільовані (містять роlу(А)-«хвіст» із приблизно 200 залишків аденозину).

Наявність ро1у(А)-хвоста дозволяє відокремити мРНК від рибосомної і транспортної РНК. Для цього сумарну еукаріотичну РНК пропускають через колонку, заповнену целюлозою, до якої «пришиті» короткі олігонуклеотидні ланцюжки з тимідинових залишків завдовжки до 15 ланок, oligo(dT). Ро1і(А)-хвости молекул мРНК спаровуються із oligo(dT) і затримуються в колонці, а молекули тРНК і рРНК вільно проходять через неї. У подальшому колонку промивають буфером, у якому відбувається розрив водневих зв'язків між А і Т, та мРНК вивільняється.

Рис. 29. Принцип експерименту щодо блот-гібридизації

(за Саузерном)

Саму мРНК не можна вмонтувати у ДНК-вектор, спочатку на ній необхідно синтезувати дволанцюгову ДНК. Для цього послідовно використовують дві різні полімерази: зворотню транскриптазу й фрагменти Кленова ДНК- полімерази І. Спочатку в реакційну суміш із очищеної мРНК додають короткі oligo(dT), зворотню транскриптазу й чотири dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Poli(A)- хвіст мРНК спаровується з oligo(dT), який містить вільну 3'-ОН-групу, що ініціює синтез комплементарного ланцюга. Матрицею вцьому синтезі є молекула мРНК, а каталізує його зворотна транскриптаза, що продукується деякими ретро-вірусами. Вона послідовно приєднує до ланцюга^ що зростає, залишки Т, С, Gабо А, комплементарні A, G, С або UмРНК. Invitro синтез ДНК йде не до кінця, при цьому зворотня транскриптаза перед зупинкою звичайно «повертає назад» і приєднує декілька нуклеотидів у зворотному напрямку. А тому в результаті утворюється «шпилька».

У реакційну суміш додають фрагмент Кленова ДНК-полімерази І Е. соli, що добудовує другий ланцюг ДНК, використовуючи перший ланцюг як матрицю. Він приєднує дезоксинуклеотиди до зростаючого ланцюга, починаючи з 3'-ОН-кінця шпильки По закінченні синтезу препарат обробляють ферментом РНКазою Н, що руйнує молекули мРНК, і нуклеазою SI, що відщеплює одноланцюгові кінці ДНК. Отриманий препарат являє собою суміш частково й повністю дволанцюгових комплементарних ДНК-копій (кДНК) мРНК, що переважно містилася у вихідному зразку.

Різні кДНК можна вбудовувати в плазмідний вектор і отримати кДНК-бібліотеку. Для скринінгу кДНК-бібліотеки з метою ідентифікації клонів, що несуть специфічні гібридні плазміди, можна використовувати метод гібридизації або імунологічні методи. В останньому разі кДНК повинна бути вбудована в сайт, що перебуває під контролем бактеріального промотора, що забезпечує транскрипцію. Однак, практично жоден вектор не гарантує, що у вбудованої кДНК збережеться правильна рамка зчитування й синтезується правильний поліпептидний ланцюг. Проте всі позитивні клони, виявлені тим або іншим методом, необхідно піддати подальшій перевірці й ідентифікувати ті з них, які несуть повно розмірну нуклеотидну послідовність, що кодує білок-мішень.

Дата добавления: 2017-02-01