Натуральные килери

Однако, не все лимфоциты крови относятся к этим двум основным популяциям клеток Т – или В лимфоцитов. В сумме количество Т – и В — клеток никогда не достигает 100 %. Часть (до 10%) клеток не имеют признаков ни Т –, ни В — клеток. Это – так называемая третья популяция клеток, яки не имеют признаков ни Т-, а ни В-клитин. Они зовутся лимфоцитами.и

Среди них выделяются К — клетки (то есть — киллеры), которые осуществляют антитилонезависимоую цитотоксичность, то есть их киллерное действие реализуется в результате активациикомплексом антиген-антитило-. Они уничтожают опсонизированные антителами (главным образом класса IgG и IgM) клетки, преимущественно бактериальные.

Но есть и нулевые лимфоциты, которые не активируются комплексом АГ — АО. Это природные, или натуральные киллеры (НК, ПК или NK). Природные киллеры, по мнению ряда исследователей, является главным неспецифическим фактором протипухлинного защите. Они имеют неспецифическую протипухлинну активность, распознают любую опухолевидную клетку и уничтожают ее в результате с ее поверхностью и перфоринив. Перфорини вкореняются в мембрану опухолевидной клетки и приводят к появлению в клеточной оболочке «дыры», через которую идет прямой обмен между цитоплазмой и внешней средой. Клетка погибает.

Натуральные киллеры имеют именно неспецифическую протипухлинну активность, они распознают любую опухолевидную клетку без предыдущего иммунного ответа против ее антигенов.

Однако, для осуществления такого эффекта, лимфоцит должен быть активированным. Активация НПК – лимфоциту осуществляется в результате совокупления его рецептора с g – интерфероном. g – интерферон образуется активированным Т – хелпером. Для дозревания и дифференцирования лимфоциту очень необходим 2, также продукт активированного Т – хелпера. Таким образом, иммунный процесс приводит к поддержке на высоком уровне противоопухолевой защиты.

Таким образом, киллеры выполняют против опухолевых клеток ту самую функцию, что и нейтрофилы против инфекционных агентов — неспецифическую.

Допускают, что стимуляция иммунной системы, как и ввод 2 и g – интерферонуа, могут пидвищуватиють протипухлинний защита организма, что и используется при терапии онкозаболеваний (БЦЖ, вакцина с Corynebacterium parvum).

РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Протченко П.З. Загальна мікробіологія, вірусологія та імунологія. Вибрані лекції: Навч. посібник. – Одеса: Одес. Держ. мед. ун-т, 2002. – 298 с.

2. Пяткін К. Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія. - К: Высшая школа, 1992. - 432 с.

Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. - М: Медицина, 1983. - 312 с.

3. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. Борисова Л.Б. – Г.: Медицина, 1993. – 232 с.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник под ред. А.А.Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 691 с.

5. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /ред. Л.Б. Борисов, А.М. Смирнова. - М: Медицина, 1994. - 528 c.

Лекция 9 ТЕОРИИ ИММУНОГЕНЕЗА. РЕАКЦИИ «АНТИГЕН-АНТИТЕЛО»

1. ВАРИАНТЫ КЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

В ИММУНОГЕНЕЗЕ

На предыдущей лекции мы рассмотрели механизмы иммунного ответа при обязательном участии всех трех типов иммунокомпетентных клеток:макрофага, Т- и В-лимфоцита. При этом развивается полноценный гуморальный ответ с синтезом специфических антител. Но возможны и другие варианты:

1. Если В-лимфоцит реагирует с антигеном без участия макрофага - развивается иммунологическая толерантность.

2. Если на В-лимфоциты действуют лишь стимулирующие его лимфокины без участия антигена - идет синтез неспецифических иммуноглобулинов, поликлональная стимуляция В-лимфоцитов.

3. Если В-лимфоцит распознает антиген на мембране макрофага без участия Т-хелперов, то синтезируются только IgM, не происходит переключения на синтез IgG и тормозится вторичный иммунный ответ (как Вы помните, вторичный иммунитет характеризуется синтезом IgG). Например, липополисахаридные антигены грамотрицательных бактерий - энтеропатогенных кишечных палочек являются тимуснезависимыми и могут вызывать только синтез IgM. А этот класс иммуноглобулинов не проходит через плаценту, поэтому у детей периода новорожденности нет материнских антител к таким штаммам эшерихий и они легко заболевают колиэнтеритами при заражении энтеропатогенными сероварами кишечной палочки.

2. ПЕРВЫЕ ТЕОРИИ ИМУНОГЕНЕЗА

Среди множества теорий иммуногенеза, предложенных за всю историю развития иммунологии, только некоторые сохранили значение до настоящего времени, хотя многие теории были удостоены Нобелевской премии. Конечно, первая из серьезных теорий иммунитета - фагоцитарная теория И.И.Мечникова(1882 г.) не только не потеряла своего значения, но и получает все больше подтверждений и дальнейшее развитие. Но эта теория не объясняет главного вопроса иммунологии - каким образом иммунная система распознает "не свое" и образует строго специфичные к антигену антитела и сенсибилизированные лимфоциты. Теория боковых цепей П.Эрлиха (1901 г.), удостоенная Нобелевской премии вместе с теорией Мечникова, потеряла свое значение в настоящее время, так как оказалась во многом умозрительной и не подтвердилась при углублении наших знаний о структуре и функции клеток. Но один из главных принципов этой теории - отбор предсуществующего, был использован при построении ряда современных теорий иммуногенеза, в том числе и наиболее популярной в наше время теории Бернета. Суть теории Эрлиха в том, что в клетке предсуществуют рецепторы для связывания с различными веществами, антиген взаимодействует со специфическим рецептором к нему, вызывает разрушение рецептора, а клетка начинает гиперпродукцию именно этого рецептора. Рецептор отделяется от клетки и циркулирует в качестве антитела в жидкостях организма. Иммунология длительное время развивалась в русле теории Эрлиха, многие иммунологические термины введены Эрлихом. Но на одной клетке не могут быть рецепторы к любому антигену, не будет места для такого количества рецепторов.

3. ИНСТРУКТИВНЫЕ И СЕЛЕКТИВНЫЕ ТЕОРИИ

Принято делить все теории иммуногенеза на инструктивные, постулирующие участие антигена в качестве матрицы для синтеза антител и селективные, постулирующие отбор предсуществующего. Наиболее развитой была инструктивная теория Полинга-Гауровитца, удостоенная Нобелевской премии. По этой теории формирующаяся пептидная цепь иммуноглобулина свертывается вокруг антигена как вокруг матрицы, замыкаются водородные связи и получается молекула антитела, точно соответствующая конфигурации молекулы антигена.Но мы сегодня знаем, что матрицей для синтеза белка служит информационная РНК,а не белок, и конформация молекулы определяется её первичной структурой а не постсинтетическими изменениями. Поэтому даже авторы этой теории официально признали ее несостоятельность. Из селективных теорий наиболее популярной и соответствующей современным фактам является клонально-селекционная теория австралийского ученого Ф.Бернета (1957 г.). Теория в последующем уточнялась и пересматривалась в свете новых данных как автором, так и другими исследователями. В этой теории использован принцип Эрлиха об отборе предсуществующего, но не готовых антител, а антителообразующих клеток.

4. КЛОНАЛЬНО-СЕЛЕКЦИОННАЯ ТЕОРИЯ БЕРНЕТА

Основные постулаты клонально-селекционной теории Бернета:

1. Лимфоидная ткань клонирована, она состоит из множества семейств (клонов) клеток, каждый из которых имеет предетерминированную (заранее причинно обусловленную) способность продуцировать антитела к одному и только к одному какому-либо антигену.

Поскольку лимфоидная ткань имеет множество таких клонов, то в целом иммунная система может реагировать на любой антиген. Бернет полагал, что возможных антигенов на Земле не более 5-10 тыс. Теперь количество возможных антигенов оценивают примерно в 100 тыс.

2. Антиген отбирает и вызывает пролиферацию только того клона клеток, который заранее способен продуцировать антитела к этому антигену, т.е. проводит селекцию клонов.

Это возможно, потому что соответствующий клон лимфоцитов генетически наделен способностью синтезировать иммуноглобулины к этому антигену. В покое, в отсутствие стимуляции антигеном, образуется лишь небольшое количество иммуноглобулинов. Они обнаруживаются на лимфоците как поверхностные IgM и IgD, которые при контакте с соответствующим антигеном дают сигнал к размножению и дифференцировке такого лимфоцита в клон иммуноглобулин-синтезирующих плазматических клеток. Образовавшийся клон клеток представляет собой достаточно большую популяцию, чтобы образоующиеся ею антитела можно было измерить в крови.

Эти два постулата теории Бернета вполне согласуются с современными знаниями по клеточным основам иммунного ответа. В этом легко убедиться, если вспомнить материал предыдущей лекции. Необходимо лишь сделать некоторые дополнения.

Клонально-селекционная теория имеет надежное морфологическое подтверждение. Антитело-образующие клетки от высоко стимулированных животных, идентифицированные с помощью флюоресцирующих антител, имеют тенденцию к группировке в скопления. При световой микроскопии эти клоны выглядят как части типичных герминативных центров с разделяющимися клетками в центре и лимфоцитами, иммунобластами и плазматическими клетками по периферии.

Клональная теория гармонирует с динамикой первичного и вторичного иммунного ответа. Скрытый период первичного ответа дает время, требуемое для трансформации лимфоцитов в клетки памяти и плазматические клетки. Каждому типу иммуноглобулинов (IgG, IgA, и IgM) и для каждой антигенной детерминанты формируются соответствующие отдельные клоны клеток. Эксперименты показали, что одна клетка лимфоидной ткани, культивируемая вне организма, образует антитело только к одному антигену.

Признание того, что B клетки от нормального, неиммунизированного животного имеют IgM и IgD молекулы, рассеянные по их поверхности, было принято как материальное свидетельство наличия рецепторов, постулированных ранее П.Эрлихом и включенных в селекционные теории образования антител.

Новыми аргументами в поддержку клонально-селекционной теории стало открытие, что эмбриональные клетки содержат структурные гены для иммуноглобулинов до воздействия антигена, и что зрелые клетки используют те же самые биохимическые процессы для синтеза иммуноглобулинов,что и для синтеза других белков.

3. Контакт с антигеном в периоде иммунологической незрелости (в эмбриогенезе) приводит не к стимуляции, а к подавлению соответствующего клона. На этом основании Бернет объяснял иммунологическую толерантность отсутствием клонов лимфоцитов, способных реагировать на антигены, с которыми организм сталкивается в периоде иммунологической незрелости.

Этот постулат в настоящее время не разделяется большинством исследователей, а механизм развития толерантности объясняется действием специфических лимфоцитов-супрессоров.

4. Многообразие клонов формируется, по теории Бернета, в результате соматических мутаций в эмбриогенезе. Этот издавна критикуемый постулат теории в настоящее признается лишь частично.

Современная иммунология объясняет разнообразие предсуществующих клонов клеток с учетом нескольких механизмов. В 1986 г. японский исследователь Тенегава был удостоен Нобелевской премии за большой вклад в изучение этого вопроса.

С помощью методов генной инженерии доказано, что число генов, контролирующих синтез иммуноглобулинов и рецепторов Т-лимфоцитов, специфических реагирующих с антигеном, ограничено. Однако, в отличие от генов других белков, они имеют фрагментарную организацию, фрагменты генов разбросаны в хромосоме во многих экземплярах. В ходе развития плазматической клетки эти фрагменты собираются в функционирующий ген случайным образом. Не вдаваясь в количественные подробности об устройстве сегментов ДНК для разных участков цепей иммуноглобулинов и рецепторов лимфоцитов, скажем, что в результате может образоваться 10 млн. вариантов генов для иммуноглобулина. Да еще число вариантов может возрастать из-за нестандартности соединения сегментов. Этот процесс завершается до встречи клеток с антигеном. К этому времени формируется популяция иммунокомпетентных клеток с широким диапазоном специфичности, но с конкретным антигеном взаимодействуют лишь наиболее адекватные клетки. Затем, во время пролиферации отобранных клонов лимфоцитов под влиянием антигена, включается мутационный механизм. Мутации осуществляют тонкую настройку рецепторов лимфоцитов (в том числе и иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов) таким образом, что создаются гены, продукты которых наиболее подходят для взаимодействия с данным антигеном. Если комбинаторный механизм до контакта с антигеном дает примерно 10 млн типов иммуноглобулинов, то после соматических мутаций их число возрастает в 100 раз. А этого более чем достаточно!

5. ТЕОРИЯ П.Ф.ЗДРОДОВСКОГО

Вышеописанные теории рассматривают иммуногенез в отрыве от целостного организма. Теория отечественного ученого П.Ф.Здродовского удачно объединила теорию Бернета с теорией нейрогуморальной регуляции физиологических функций организма Г.Селье. По Здродовскому антиген, как стрессор, вызывает раздражение гипофиза неспецифично по отношению к антигену. Гипофиз продуцирует соматотропный гормон (СТГ) и адренокортикотропный гормон (АКТГ). СТГ вызывает стимуляцию размножения клеток, а АКТГ через усиление продукции надпочечником кортикостероидов - подавляет размножение клеток. Превалирование одного процесса над другим зависит от дозы антигена, состояния организма, условий. Идет нейрогуморальная регуляция иммуногенеза. А специфическое действие антигена заключается в отборе соответствующего клона лимфоцитов по Бернету.

6. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕАКЦИЙ " АНТИГЕН-АНТИТЕЛО "

Механизм реакции АГ-АТ заключается в образовании связи паратопа антитела с эпитопом антигена, активного центра антитела с антигенной детерминантой. С учетом как минимум двухвалентности антитела и обычной многовалентности антигена создается возможность образования прочной решетки. Теория решетки до настоящего времени привлекается для объяснения образования прочных комплексов антиген-антитело. Имеет значение соотношение количеств реагирующих компонентов, в избытке антигена и в избытке антитела комплексы не только не образуются, но и может раствориться уже образовавшийся комплекс антиген-антитело. При этом нет видимого результата реакции, хотя взаимодействие АГ-АТ произошло. Количественные соотношения АГ и АТ необходимо учитывать при постановке реакций. Принято выделять две фазы реакций АГ-АТ: первую, специфическую, не зависящую от электролитов (собственно специфическая реакция между паратопом и эпитопом), невидимую, и вторую, неспецифическую, требующую присутствия электролитов и дополнительных условий, видимую. Например, взаимодействие микробов с антителами в безэлектролитной среде приводит к связыванию антител, хотя видимой реакции и не происходит.

7.СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

7.1. Реакции между антигеном и антителом называют гуморальными реакциями или же серологическими (от лат. serum - сыворотка). Эти реакции проходят в организме для борьбы с антигеном, а в лабораторных условиях мы ставим серологические реакции для решения ряда диагностических задач. Названия этих реакций могут быть различными. Нужно лишь понимать, что название реакции отражает главным образом то, что происходит с антигеном. На­при­мер: ре­ак­ция пре­ци­пи­та­ции, агг­лю­ти­на­ции, ли­зи­са, свя­зы­ва­ния ком­пле­мен­та. Со­от­вет­ст­вен­но и ан­ти­те­ла, уча­ст­вую­щие в такой реакции, называют преципитинами, агглютининами, лизинами, комплементсвязывающими, антитоксинами, вируснейтрализующими антителами и т.п. Реально это может быть одно и то же антитело, но внешний результат реакции различен из-за различий в условиях постановки и учета. Если говорят, что обнаружены агглютинины - значит антитела обнаружены в реакции агглютинации и т.д. Вы­де­ля­ют: двух­ком­по­нент­ные ре­ак­ции - РА, РП, РН; трех­ком­по­нент­ные - им­мун­но­го ли­зи­са, оп­со­ни­за­ции, РСК, ре­ак­ции с ме­че­ны­ми реа­ген­та­ми - РИФ, РИА, ИФА.

7.2. Реакция преципитации (РП) - это осаждение растворенного антигена под действием антител.

Когда антитело соединяется с антигеном в растворе образуется преципитат, то есть осадок комплекса антиген-антитело. Реакция может быть проведена различными способами:

1. Простое смешивание. Раствор антигена смешивается с антителом в пробирке и оставляется для осаждения. Эта реакция идет быстро (несколько минут при 37 °C), и преципитат оказывается наиболее массивным, когда антиген и антитело присутствуют в оптимальных соотношениях. Избыток антигена или антитела может подавлять формирование преципитата - феномен прозоны (этот феномен наблюдается и при других реакциях антиген-антитело).

2. Реакция кольцепреципитации. Раствор антигена наслаивают на поверхность антитела в узкой пробирке или капилляре. На границе соприкосновения двух жидкостей образуется узкое кольцо преципитата. Реакция кольцепреципитации требует малых количеств реагентов и происходит быстро.

3. Преципитация в геле (двойная диффузия), иммунодиффузия. Антиген и антитело диффундируют навстречу друг другу в агаровой среде из отдельных лунок, выбитых в пластине агара (рис. 1)

Реакция преципитации в геле применяется, например, для определения токсигенности некоторых бактерий, например - Corynebacterium diphtheriae. Производят посев культуры микроорганизмов под прямым углом к помещенной на поверхность питательного агара полоске фильтровальной бумаги, содержащей иммунную сыворотку. Если культура продуцирует токсин, образуется линия преципитации.

4. Простая р адиальная иммунодиффузия по Манчини. Антиген помещается в лунку, выбитую в геле агара, содержащем антитело в соответствующем разведении. Кольцо преципитата формируется там, где реагенты встречаются в оптимальных пропорциях. Чем выше концентрация антигена, тем больше диаметр кольца. Измерение диаметра кольца преципитата позволяет количественно определять антиген.

Этот метод используется для определения концентрации IgG, IgM и IgA в сыворотке человека.

5. Иммуноэлектрофорез объединяет методы иммунодиффузии и электрофореза. Иммуноэлектрофорез проводится в две стадии. Сначала жидкость, содержащая белковые антигены, помещают в лунку геля и проводят электрофорез. Антигены распределяются параллельно направлению электротока в виде отдельных пятен по линии, проходящей через лунку. Каждое пятно является индивидуальным компонентом исследуемой смеси антигенов. Когда ток выключают, проводят иммунодиффузию. Для этого заполняют канавку, проходящую параллельно направлению электрофореза, соответствующей иммунной сывороткой. Молекулы антитела иммунной сыворотки распространяются перпендикулярно фронту движения антигенов. Дуга преципитата, или линия преципитации, формируется только там, где каждый компонент комплекса антиген-антитело встречаются в зоне эквивалентности. Этот метод широко используется для анализа белковых компонентов образцов сыворотки. Таким способом могут быть обнаружены, например, измененные иммуноглобулины в сывопротке.

7.2. Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации - склеивание корпускулярного антигена под действием антител.

Как говорилось ранее, реакция преципитации происходит с растворимым антигеном. В реакции агглютинации, напротив, участвуют корпускулярные антигены (эритроциты, бактериальные клетки и др.). Корпускулярные антигены с эпитопами на их поверхности могут быть перекрестно связаны специфическими антителами и формировать большие скопления или агрегаты (рис. 2).

Когда антитела реагируют с эпитопами на соседних антигенах, корпускулярный антиген соединяется в видимые хлопья. При прямой агглютинации (показанной на рисунке) антитело реагирует со свободным корпускулярным антигеном в суспензии.

Рис 2. МЕХАНИЗМ АГГЛЮТИНАЦИИ

Этот процесс называется агглютинацией, антитела, которые участвуют в этом процессе, называют агглютининами, а антиген - агглютиногеном.

Реакция может быть поставлена двумя способами - на стекле и в пробирках.

Реакция агглютинации на стекле -обычно ориентировочная или качественная реакция. Клетки (живые или убитые бактерии, эритроциты) суспендируют в капле солевого раствора на предметном стекле и добавляют небольшую каплю иммунной сыворотки. Предметное стекло слегка покачивают в течение одной-двух минут и отмечают наличие или отсутствие агглютинации. Постановка контроля (суспензия бактерий в физиологическом растворе без добавления сыворотки) необходима для исключения возможной самопроизвольной агглютинации.

Пробирочная реакция. Это - обычно подтверждающая и количественная реакция. К последовательным разведениям антисыворотки в пробирках добавляют стандартное количество суспензии клеток. Пробирки инкубируют и наибольшее разведение иммунной сыворотки, в котором еще наблюдается реакция агглютинации, принимают за титр агглютининов.

Реакция агглютинации значительно осложняется комплексностью антигенной структуры бактерий. Таким образом, неизвестную сыворотку приходится испытывать отдельно со жгутиковыми (Н), и соматическеми (O) антигенами различных бактерий. Наоборот идентификация неизвестного микроорганизма может потребовать ряда иммунных сывороток, каждая из которых специфична к одному известному антигену.

Реакция агглютинации широко используется для идентификации видов Salmonella, Shigella, сероваров Escherichia coli, Neisseria meningitidis и других бактерий.

Среди бактериальных болезней человека, для которых реакция агглютинации имеет диагностическую ценность - брюшной тиф (реакция Видаля), сальмонеллез, бруцеллез (реакция Райта), туляремия, сыпной тиф и другие.

Вариантом прямой реакции агглютинации является непрямая, или пассивная реакция агглютинации (рис. 3).

Рис. 3. СХЕМА РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ

Этот вариант позволяет использовать в реакции агглютинации многие растворимые антигены. В реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) антигены (бактериальные компоненты или вирусные частицы) адсорбируют предварительно на поверхности эритроцитов. Эритроциты с адсорбированным на них антигеном реагируют, как будто они сами обладают специфичностью адсорбированного антигена. На рис. 3 показана пассивная агглютинация с эритроцитами, на которых адсорбирован антиген. Когда специфическое антитело добавляется к эритроцитам с адсорбированным на них антигеном, образуются мостики из антитела между клетками, формируются большие скопления клеток. Они легко заметны невооруженным глазом.

Этот метод более чувствителен чем обычные реакции преципитации и может быть использован для тканевых антигенов, вирусов, анатоксинов и других антигенов, которые трудно исследовать другими методами.

Если к эритроцитам присоединять не антиген, а антитела, становится возможным определять неизвестный антиген с помощью такого антительного диагностикума. Такая реакция называется реакцией обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА).

Реакция латекс-гглютинации похожа на РНГА, но вместо эритроцитов антиген или антитело адсорбируется на частицах латекса.

7.3. Реакция биологической нейтрализации - обезвреживание токсина или микроорганизма антителами (антитоксинами, антимикробными или вируснейтрализующими).

Когда антитело соединяется с токсином, ядовитое действие токсина нейтрализуется. На этом основано применение антитоксических сывороток для лечения болезней, в патогенезе которых принимает участие экзотоксин (дифтерии, столбнякя, ботулизм и др.).

Так как токсин - это растворенный антиген, он также преципитируется (такая реакция называется реакцией флоккуляции).

Токсины и антитоксины могут быть измерены в биологических тестах по гибели животных, кожных пробах на животных и у чиловека (например - проба Шика при дифтерии, проба Дика при скарлатине), реакции нейтрализации на клетках в культуре тканей.

Антитоксины также нейтрализуют любые проявления ядовитого эффекта токсина in vitro: лецитиназа Clostridium perfringens подавляется противогангренозной сывороткой, гемолитическая активность стрептолизина O нейтрализуется антистрептолизином O, который появляется в сыворотке больных, инфицированных большинством штаммов гемолитического стрептококка.

Обезвреживание наступает не всегда. Эндотоксины грам-отрицательных бактерий могут соединяться со специфическими антителами, но оставаться токсическими. Некоторые ферменты могут преципитироваться антителами, но все сохранять свою специфическую каталитическую активность.

7.4. Реакция связывания комплемента.

Комплемент принимает участие во многих иммунологических реакциях и связывается при соединении антигена с антителом. Способность комплексов антиген-антитело адсорбировать комплемент используется в реакции связывания комплемента (РСК). Это универсальная и чувствительная реакция, применимая для различных типов антигенов и антител. РСК - сложная реакция, состоящая из двух этапов и пяти реагентов: антигена, антитела, комплемента, эритроцитов барана и гемолитической сыворотки (сыворотки против эритроцитов барана).

РСК включает две системы: опытную систему, в которой антиген и антитело реагируют в присутствии лимитированного количества комплемента и гемолитическую систему, в который устанавливается, связался ли комплемент, или нет. Так как сыворотка крови человека содержит неодинаковое и неизвестное количество комплемента, все сыворотки, используемые в реакции прогревают (при 56 °C в течение 30 минут) для инактивации собственного комплемента сыворотки и добавляют известное количество комплемента (1,25-1,5 титра) в виде свежей или консервированной сыворотки морской свинки.

1. Опытная система. Антиген, антитело и комплемент смешивают и инкубируют в термостате для взаимодействия. Если антиген встречается со специфическим антителом, они взаимодействуют, и комплемент связывается. Если антиген не встречается со специфическим антителом, реакция не происходит, и комплемент остается несвязанным. Когда реакция завершается, присутствие или отсутствие комплемента в опытной системе определяют в отдельном эксперименте, используя гемолитическую систему.

2. Гемолитическая система. Она состоит из суспензии эритроцитов барана в смеси с гемолитической сывороткой, которая сенсибилизирована в результате предварительной инкубации при 37 °C в течение 30 минут. Гемолитическую систему добавляют к опытной системе инкубируют также при 37 °C в течение 30 минут. Если антиген соединился со специфическим антителом, комплемент связывается и не участвует в гемолизе - эритроциты остаются неповрежденными, РСК положительна. Если же антиген не соединился со специфическим антителом, комплемент остается свободным, и может происходить гемолиз: суспензия эритроцитов просветляется с выходом гемоглобина в раствор, результат РСК отрицателен.

РСК широко используется для обнаружения антител при заболеваниях, вызванных риккетсиями, хламидиями, микоплазмами, вирусами, простейшими и гельминтами. РСК широко используется в диагностике сифилиса (реакция Вассермана).

7.5. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

В реакции иммунофлюоресценции используются молекулы антитела, меченые флюоресцентным красителем типа изотиоцианата флюоресцеина, чтобы обнаружить антиген. Например, она используется для быстрой идентификации неизвестного инфекционного агента в исследуемом материале, в котором, чаще всего находится смесь микроорганизмов. Мазки, содержащие бактерии, вирусы, и т.д. исследуют под люминесцентным микроскопом и участки, где антитело присоединилось к антигену, могут быть обнаружены по их флюоресценции. Флюоресцеин дает желто-зеленую флюоресценцию. Флюоресцентная краска может быть присоединена к антителам, они тогда называются мечеными, или флюоресцирующими (люминесцирующи-

ми) антителами.

В реакции прямой флюоресценции антитела (рис.4) флюоресцентная краска непосредственно коньюгирована с антителами, специфичными к антигену. Культура микроорганизмов (или исследуемый материал), фиксированные на предметном стекле с помощью высокой температуры или спирта, обрабатывается раствором специфического люминесцирующего антитела, и молекулы антитела могут взаимодействовать с антигенами на поверхности клеток. После промывания мазка от несвязавшихся антител его микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Будут видны только те микроорганизмы, которые прореагировали с мечеными антителами специфически.

Рис. 4. Прямая реакция иммунофлюоресценции

Антигены часто могут быть обнаружены более просто с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции. Исследуемый материал вначале соединяют с немечеными специфическими антителами (глобулинами) сыворотки крови определенного вида животных.

Локализацию этих антител затем устанавливают с помощью меченой флюоресцеином антиглобулиновой сыворотки. Например, меченая сыворотка против глобулинов человека, полученная путем иммунизации кролика человеческим глобулином, может быть использована для обнаружения человеческих антител. Эта реакция более чувствительна и более широко используется, чем прямая РИФ.

7.6. Иммуноферментный анализ (ИФА).

Иммуноферментный анализ - высокочувствительный, дающий возможность определять антиген в концентрации ниже 1 пикограмма (10^{-12 г) на милилитр, простой в применении метод. Кроме того, он более дешев, потому что не требует дорогостоящей аппаратуры, и более безопасен, потому что не требует применения радиоактивных материалов, но такой же точный и надежный, как и радиоиммунный метод. ИФА основан на следующих двух феноменах.}

1. Антитела и некоторые антигены могут адсорбироваться на лунках полистироловых пластин (или другом твердом носителе) и полностью сохранять иммунологические свойства.

2. Антигены и антитела могут быть связаны с ферментами с полным сохранением функциональной активности коньюгатов, как иммунологических, так и ферментативных. Вот почему этот метод называется иммуноферментным. В английской литературе его называют чаще ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Активность фермента используется для того, чтобы измерить количество антигена или антитела, содержащихся в пробе. Для ИФА используют ферменты пероксидазу, щелочную фосфатазу, b-галактидазу и глюкозоксидазу.

Имеются два основных варианта ИФА, которые применяются для клинических целей: двойной сэндвич-метод для обнаружения и измерения антигена; и непрямой иммуносорбционный метод для обнаружения и измерения антитела. Последний метод представлен на рис. 5. Начальный этап непрямого ИФА включает адсорбцию антигена на стенках лунки. Добавляют исследуемую сыворотку и инкубируют. Если антитела сыворотки связались с иммобилизированным антигеном, их присутствие обнаруживается путем добавления меченого ферментом антиммуноглобулина (анти-Ig G или анти-IgM). Затем добавляют субстрат для фермента; степень гидролиза субстрата соответствует изменению цвета и пропорциональна концентрации антител, присутствующих в пробе. Окрашивание может наблюдаться визуально или спектрофотометрически.

При двойном сэндвич-методе иммунную сыворотку адсорбируют на стенках лунок планшета. Добавляют исследуемый антиген, и, если он специфичен антителам, антиген связывается с адсорбированными на стенках лунки антителами. Добавляют коньюгат антител с ферментом. Антитела связываются с антигеном, уже фиксированным

первым антителом, создавая «сэндвич»: коньгат фермента с антителом-антиген-антитело. Наконец, доавляют субстрат для фермента. Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству связанного с ферментом антитела, а оно, в свою очередь, пропорционально количеству исследуемого антигена. Количественный учет реакции проводят спектрофотометрически.

ИФА используется для обнаружения многих инфекционных вирусов, бактерий, грибов, и паразитов типа простейших. Например, один образец иммунной сыворотки от беременной женщины может быть исследован одновременно на многие инфекционные болезни, напаример, вызываемые вирусом краснухи (который может вызвать врожденные пороки развития или внутриутробную смерть) и вирусом герпеса типа 2 (который может вызвать серьезные врожденные пороки развития нервной системы и в результате микроцефалию).

7.7. Другие типы реакций антиген-антитело.

Дата добавления: 2014-01-04