Выделение чистой культуры клубеньковых бактерий

Выделение и изучение чистых культур клубеньковых бактерий

Материалы и оборудование (к 12.3—12.4)

Стерильные колбы Эрленмейера на 250 мл, (NH₄)₂SO₄, CaCO₃, газо­вый хроматограф любой марки с пламенным ионизационным детек­тором, сосуды с пробкой из силиконовой резины, шприцы, газометры для приготовления газовых смесей, прибор для определения актуаль­ной и потенциальной активности азотфиксации по Умарову, пенициллиновые флаконы, ацетилен, бобовое растение с клубеньками, реактив Несслера.

Из клубеньков однолетних бобовых растений бактерии выделя­ют в период бутонизации — цветения растения-хозяина, из клубеньков многолетних растений — на втором году жизни.

От тщательно промытого в водопроводной воде корня отделяют пинцетом или бритвой наиболее крупные розовые клубеньки, помещают их в фарфоровый тигель Гуча с сетча­тым дном, который погружают в большие по размеру фарфо­ровые чашки с 96%-ным этиловым спиртом на несколько минут. После этою клубеньки многократно промывают сте­рильной водой.

Стерильным пинцетом клубеньки переносят в стериль­ную чашку Петри и стерильным ножом разрезают на части. Бактериологической петлей берут небольшое количество содержимого клубенька, переносят в каплю стерильной воды на поверхность агаровой питательной среды в чашке Петри и раз­мазывают шпателем. Этим же шпателем делают посев последо­вательно еще на 2—3 пластинах для получения отдельных ко­лоний (истощающий посев).

Засеянные чашки выдерживают в термостате при 25— 27 °С. Быстрорастущие клубеньковые бактерии появляются на 3—4-е сут, медленнорастущие — на 7—9-е. Появление колоний на 1—2-е сут свидетельствует о загрязнении культуры.

Питательной средой служит среда Фреда: маннит (сахаро­за или глюкоза) - 10,0 г; КН₂РО₄ - 0,5 г; MgSO₄ - 0.2 г; NaCl — 0,1 г; СаСО₃ — 3,0 г; дрожжевая вода (рН 6,8) — 100 мл; агар — 15 г; дистиллированная вода (рН 7,0) — 0,9 л.

Можно использовать бобовый агар следующего состава: бобовый отвар — 1000 мл; сахароза — 2 г; КН₃РО₄ — 1,0 г, MgSO₄ - 0,3 г; агар - 15,0 г.

В бобовый агар добавляют NaHCO, до рН 7,0 и стерили­зуют при 120°С 30 мин.

Для приготовления бобового отвара 50 г бобов (белой фа­соли или гороха) заливают 1 л водопроводной воды и варят до набухания и растрескивания кожуры (бобы не должны разва­риваться). Отвар фильтруют через вату (марлю) и доводят во­допроводной водой до 1 л.

На этих средах клубеньковые бактерии образуют бес­цветные или молочно-белые, часто слизистые, колонии, за исключением розово-красных колоний клубеньковых бактерий из клубеньков Lotononis bainesii.

На скошенном бобовом агаре быстрорастущие клубеньковые бактерии обильно развиваются, образуя доволь­но прозрачные слизистые, часто стекающие вниз мощные ко­лонии-штрихи.

Медленнорастущие бактерии люпина и сои обра­зуют менее прозрачные с небольшим количеством слизи и бо­лее плотные, похожие на капли стеарина, беловатые коло­нии-штрихи.

Клубеньковые бактерии хорошо растут также на:

· среде Лазаревой (на 1 л водопроводной воды): КН₂РО₄ — 0,5 г; MgSO₄ - 0,2 г; NaCl - 0,2 г; MnSO₄ - 0,005 г; NH₄MoO₄ -0,002 г; маннит или сахароза — 10 г; дрожжевая вода — 100 мл, агар — 1,5%;

· среде Норриса (на 1 л водопроводной воды): К₂НРО₄ — 0.5 г; MgSO₄ · 7H₂O- 0,8 г; NaCl - 0,2 г; FeCI, - 0,01 г; маннит — 10 г; свежеприготовленный дрожжевой экстракт — 100 мл: рН 7,2.

Для медленнорастущих клубеньковых бактерий (сои. лю­пина) следует использовать среду Испарина (г/л водопроводной воды): маннит или сахароза — 10 г; К₂НРО₄ — 0,5 г; MgSO₄ — 0.2 г: NaCl — 0,1 г; глюканат кальция — 1,5 г; FеCI₃ — 0,01 г; дрожжевой экстракт — 2 г; агар — 20 г.

Для проверки чистоты выделенной культуры делают посев на МПА, так как, кроме клубеньковых бактерий люцерны и донника, ни одна культура клубеньковых бактерий на МПА не развивается.

Характерный тест для клубеньковых бактерий — рост на лакмус-молоке.

Лакмусовое молоко, или лакмус-молоко, готовят следующим образом. 50 г лакмуса измельчают в ступке и растворяют в 150 мл 40%-ного этанола. Смесь кипятят 1 мин на водяной ба­не, после отстаивания декантируют (при помощи делительной воронки), добавляют к осадку еще 150 мл 40%-ного раствора этилового спирта и снова кипятят 1 мин. Надосадочную жид­кость декантируют, объединяют с предыдущей порцией и остав­ляют на ночь. Затем доводят объем 40%-ным раствором этило­вого спирта до 300 мл. устанавливают рН 7,0, добавляя к раство­ру по капле 1 н. раствор HCI (окраска становится пурпурной).

К свежеснятому (обезжиренному) молоку добавляют го­товый лакмусовый раствор до бледно-лиловой или сине-фи­олетовой окраски последнею (около 40 мл/л). Устанавливают рН смеси, равный 7,0, добавляя 1 н. раствор NaOH. Стерили­зуют 10 мин автоклавированием при 115°С. Перегревание ве­дет к карамелизации.

Быстрорастущие клубеньковые бактерии на 10—14-е сут подщелачивают лакмусовое молоко, которое при этом слегка синеет или не меняет окраски, и образуют светлое кольцо — сывороточную зону. Только клубеньковые бактерии люцерны, донника и некоторые штаммы клубеньковых бактерий клевера подкисляют лакмусовое молоко (придают ему розовую окраску). Медленнорастущие клубеньковые бактерии лакмус-мо­локо подщелачивают, но сывороточной зоны не образуют, т. е. не гидролизуют казеин. Большинство клубеньковых бактерий не способно разжижать желатину, однако некоторые штаммы разжижают ее через 2 мес. культивирования.

Для дифференцирования бактерий рола Agrobacterium и бактерий рода Rhizobium используют кетолактозный тест.

Agrobacterium обильно развиваются, продуцируя З-кетолактозу на среде Гаура и Маречковой, содержащей (на 1 л дистиллиро­ванной воды): лактозу — 5.0 г, KNO, — 1,0 г, MgSO₄ · 7H₂О — 0,1 г, NaH₂PO₄ безводный - 0,18 г, агар- 12,0 г, Fe-ЭДТА 0,25%-ный раствор — 10 мл; MnSO₄ 33,5 %-ный раствор — 10 мл; рН 6,8. Колонии клубеньковых бактерии на этой среде обычно не растут.

Для проведения кетолактозного теста чистую культуру бактерий помещают на 1—2 сут при 25—30°С на скошенную агаризованную среду Фреда (см. выше). Затем петлей культуру переносят небольшими комочками (диаметром не более 0,5 см) на агаризованную среду Гаура и Маречковой в чашки Петри. На одну чашку можно поместить 4—6 комочков иссле­дуемых культур. Чашки инкубируют 1—2 сут при 28°C затем наливают в них тонким слоем реактив Бенедикта следующего состава: NaCI - 250 г, NH₄NO₃, - 100 г, Cu(NO₃)₂ - 250 г, во­да дистиллированная — до 1 л. Чашки оставляют при комнат­ной температуре. Если культура образует 3-кетолактозу (3-кетогалактопира-нозилглюкозу), то вокруг нее появляется желтое кольцо СuО, которое хорошо видно на голубом фоне реактива. Через 1 ч кольцо достигает максимального диаметра (2—3 см). Для бактерий рода Rhizobium кетолактозный тест всегда отри­цателен.

При просмотре под микроскопомчистой культуры живых клеток клубеньковых бактерий на препарате в раздавленной капле отмечают их большую подвижность. Каждая клетка со­вершает вибрирующие, дрожащие движения, занимая то вертикальное, то горизонтальное по отношению к глазу исследо­вателя положение. Бактерии очень полиморфны, но в основ­ном они мелкие. На фиксированных окрашенных (лучше эритрозином) препаратах четко просматривается зернистость, создающая впечатление опоясанности клеток.

Дата добавления: 2014-01-04