КАТЕГОРИИ: Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748) |
Определение специфичности клубеньковых бактерий. Отбор активных (эффективных) культур клубеньковых бактерий
Материалы и оборудование Стерильные чашки Петри, пинцет, нож, среда Фреда или бобовый агар, шпатели, корни бобового растения с клубеньками и фазе бутонизации — цветения, этиловый спирт, микроскопы и всё необходимое дли микроскопирования. Вводные пояснения. Специфичность клубеньковых бактерий — это их избирательная способность заражать определенный род, вид, семейство бобовых растений или группу родов. Критерием служит появление хотя бы одного клубенька на корнях растений, бактеризованных исследуемой культурой. При отборе высокоэффективных клубеньковых бактерий основным, наиболее надежным критерием служит их влияние на урожай растений и содержание в них азота. Некоторые клубеньковые бактерии образуют клубеньки, но при этом усвоения молекулярного азота в бобово-ризобиальном симбиозе не происходит или этот процесс идет очень слабо и потребность растений в азоте не удовлетворяется. Такие клубеньки называют неактивными, или неэффективными. Обычно они мелкие, разбросаны по всему корню, содержат мало бактероидной ткани и быстро разрушаются. Бывают случаи, когда клубеньковые бактерии образуют клубеньки, паразитирующие на растении. Для получения высоких урожаев важно подобрать высокоэффективные культуры бактерий, изучить их особенности. Предварительный отбор можно проводить в условиях лабораторного, а затем вегетационного опытов. Окончательно же эффективность проверяют при полевых испытаниях. Подбор активных культур клубеньковых бактерий по Разумовской. Его проводят в лабораторных или вегетационных опытах. Для этого берут большие (180 x 40 мм) пробирки со средой следующего состава (г/л дистиллированной воды): К2НРО4 - 1,0; MgSO4 - 1,0; СаСО3 - 0,5; FeSO4, H3BO3, MnSO4 — следы, агар — 1,0. Среду разливают в пробирки слоем 4 см, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин.
Одновременно проводят стерилизацию семян концентрированной серной кислотой по Nutman. Для этого мелкие семена погружают на 1—2 мин, а крупные — на 3—5 мин в серную кислоту, налитую в коническую колбу на 0,7—1,0 л. При этом колбу слегка покачивают. После обработки кислоту сливают и в колбу сразу же быстро вливают большую порцию стерильной водопроводной воды: если приливать воду медленно или в небольшом количестве, семена могут перегреться. Воду меняют несколько раз. По окончании промывки реакция среды на поверхности семян должна быть нейтральной (определяют лакмусовой бумагой). Стерильность семян проверяют посевом части их на МПА илибобовый агар. После прорастания семена переносят стерильнымпинцетом в пробирки с агаровой средой одновременно с 1 мл взвеси культуры клубеньковых бактерий. Для затемнения корней пробирки снаружи обертывают плотной бумагой так, чтобы она закрывала слой агара и семена. Растения выращивают при естественном или искусственном освещении. По мере их развития наблюдают за образованием клубеньков, массой растений и содержанием в них азота. Контролем служат пробирки без бактерий. Общий азот в исследуемых растениях определяют микрометодом Кьельдаля. Для этого навеску хорошо измельченного воздушно-сухого растительного материала массой около 0,2 г помещают в колбу Кьельдаля на 50—100 мл, приливают 10 мл фенолсерной кислоты и ставят на сжигание. Через сутки, когда жидкость приобретает желтую окраску, добавляют 1 каплю хлорной кислоты (если жидкость темно-бурая, то — 2). По окончании сжигания жидкость обесцвечивается. Колбу охлаждают ипереносят раствор в мерную колбу на 100 мл, тщательно и многократно маленькими порциями ополаскивая колбу Кьельдаля дистиллированной водой и сливая промывные воды в ту же мерную колбу. Затем объем раствора доводят до метки и используют для дальнейшей отгонки.
Прибор Кьельдаля состоит из отгонной колбы Кьельдаля, обратного холодильника, отстойника и колбы — парообразователя. В парообразователь наливают дистиллированную воду (не менее 2/з объема), подкисленную концентрированной серной кислотой (1—2 мл) с несколькими каплями смешанного индикатора Гроака. Данный индикатор готовят следующим образом: к 100 мл 0,2%-ного спиртового раствора метилового красного добавляют 100 мл 0,1%-ного спиртового раствора метиленового синего. Хранят его в темной склянке с притертой пробкой длительное время. В течение всей работы вода в парообразователе должна быть окрашена в розовый цвет. В парообразователь вносят небольшое количество битого кирпича. Воду в парообразователе прогревают до начала работы. Для этого в отгонную колбу через воронку наливают около 20 мл дистиллированной воды, воронку закрывают; зажигают под парообразователем горелку и доводят воду в нем до закипания. Зажим парообразователя при этом должен быть открытым, а зажим отстойника — закрытым. Под холодильником, на конец которого надета резиновая трубка с капельницей, ставят рабочий стакан (пустой или с водой). Затем осуществляют «холостой» отгон так, как описано ниже, используя вместо исследуемого раствора дистиллированную воду. Исследуемый раствор отгоняют следующим образом. Под капельницу холодильника ставят приемную колбу или стакан. В неё наливают 10 мл 2%-ного раствора борной кислоты, подкрашенной индикатором Гроака (на 1 л борной кислоты — 10 мл индикатора). Приемную колбу ставят на подставку так, чтобы капельница холодильника погрузилась в неё почти до дна. В отгонную колбу пипеткой через воронку вносят 10 мл исследуемого раствора, ополаскивают воронку небольшими порциями дистиллированной воды, добавляют 10 мл 40%-ного раствора NaOH, снова ополаскивают воронку дистиллированной водой, кран воронки закрывают и наливают в воронку дистиллированную воду. Открывают зажим предварительно нагретого парообразователя, впускают пар, придвигают горелку при закрытом зажиме отстойника.
При этом начинает выделяться аммиак, который образовался ранее при сжигании органического вещества навески и был затем связан фенолсерной кислотой. Он отгоняется в приемник, где поглощается борной кислотой с образованием бората аммония. Отгон аммиака прекращают через 5 мин с момента изменения розовой окраски раствора приемной колбы на зелёную. После этого капельницу холодильника вынимают из раствора кислоты и отгоняют пар еще 1—2 мин. Тщательно обмывают капельницу дистиллированной водой и титруют содержимое колбы 0,01 н. раствором серной кислоты из микробюретки до перехода зеленой окраски титруемого раствора в слабо-розовую. После каждого определения отставляют горелку, закрывают зажим парообразователя, приемную колбу с отгоном заменяют рабочим стаканом, открывают зажим отстойники для слива раствора из отгонной колбы; когда в отстойнике остается примерно 1/3 жидкости, зажим отстойника закрывают. Прибор снова готов к определению.
Расчет количества азота (N) (%) проводят по формуле
где а1 — количество 0,01 н. H2SO4, пошедшем на титрование «холостого» раствора, мл; а2 — количество 0,01 н. H2SO4, пошедшей на титрование испытуемого раствора, мл; 0,00014 — количество азота, связанное 1 мл 0,01 н. раствора H2SO4, г; 100 — пересчет в %; V — объем исходного раствора, мл; b — аликвота, взятая для отгона, мл; Н — навеска, г. Определение азотфиксации изотопным методом. Более точные данные о размерах азотфиксации бобово-ризобиального симбиоза можно получить, выращивая растения, инокулированные клубеньковыми бактериями, в атмосфере, содержащей меченый азот — I5N, с последующим определением количества фиксированного азота в масс-спектрометре. Инокулированные растения выращивают длительное время в изолированной камере в газовой среде, содержащей меченый I5N. При этом регулируют газовый режим, контролируют изотопный состав азота в газовой смеси и поддерживают определенную влажность. По обогащению азота газовой смеси камеры, растений и субстрата изотопом 15N рассчитывают количество азота, используемого тест - растением из воздуха, мг:
где х — количество азота, усвоенного из воздуха, мг; а — обогащение азота газовой смеси изотопом I5N, ат% I5N2; а1 — обогащение азота исследуемого образца изотопом 15N, ат% I5N2; b — содержание азота в образце, мг; 0,386 — обогащение изотопом I5N образца в естественном состоянии. Определение азотфиксирующей активности бобово-ризобиального симбиоза ацетиленовым методом по Парийской и Гореловой. Для этого растения выращивают в пробирках (2x20 — 2x30 см) с отростком, на который надевают тонкий резиновый шланг, герметично закрытый на конце стеклянной пилочкой. Пробирки на 1/4 заполняют средой следующего состава (г/л дистиллированной воды): КС1 — 0,74; КН2РО4 — 0,3; К2НРО4 - 0,3; MgSO4·7H2O - 0,5; CaSO4 - 0,5; FeCl2 - 0,04; агар - 8. Клубеньковые бактерии вносят в теплую среду в концентрации 1 • 107 клеток/мл. Проросшие семена, предварительно простерилизованные (см. выше), помещают по одному в пробирки на поверхность застывшей, засеянной ризобиями среды. Растения выращивают в оранжерее в течение месяца. Азотфиксирующую активность определяют после 16-часового светового дня, вводя в пробирки по 0,5 мл ацетилена (см. 12.4.2).
Дата добавления: 2014-01-04; Просмотров: 966; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы! Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет |