Генетична інженерія бактерій

РОЗДІЛ 2. МЕТОДИЧНІ АСПЕКТИ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ ОКРЕМИХ ГРУП ОРГАНІЗМІВ

Поряд із загальними принципами побудови рекомбінантних ДНК окремі групи живих істот - бактерії, гриби, рослини, тварини, розрізняються за способами ефективного перенесення чужорідної (сторонньої) ДНК в клітини реципієнта та мають специфічні вимоги до будови окремих ділянок рекомбінантних ДНК для забезпечення експресії трансгенів у відповідних організмів. Ефективність перенесення та експресії транс генів певним чином пов’язані з морфо-функциональною організацією, способами розмноження, стадіями життєвих циклів реципієнтів і мають враховуватися при виконанні генно-інженерних маніпуляцій з конкретним видом живих істот.

При використанні плазмідних векторів для створення рекомбінантних ДНК останні вносяться в бактеріальні клітини шляхом трансформації. Трансформація - це процес введення вільної ДНК в бактеріальну клітину. Найчастіше при трансформації рекомбінантними ДНК використовуються клітини Е.соlі. Щоб забезпечити трансформацію рекомбінантних ДНК в клітини кишкової палички їх обробляють холодним розчином СаС1₂ і витримують при 42°С протягом 1,5 хв. За такої обробки здійснюється локальне порушення клітинної стінки, що й забезпечує проникнення ДНК в клітини. Цей метод дає максимальну частоту трансформації, приблизно 10^-3, тобто на кожну 1000 клітин приходиться одна трансформована. Ефективність трансформації, яка визначається як число трансформантів на 1 мкг взятої для досліду ДНК, складає приблизно 10⁷-10⁹/мкг ДНК.

Клітини, здатні поглинати чужорідну ДНК, називаються компетентними. Компетентність Е.соlі потрібно індукувати. Деякі інші бактерії мають постійну компетентність щодо чужорідної ДНК. Долю компетентних клітин можна підвищувати, якщо використовувати спеціальне живильне середовище чи умови культивування. Зокрема, для підвищення компетентності бактерій, стійких до хімічних індукторів, використовують електропорацію. Збільшення проникності клітинних мембран досягають дією на них електричного струму. Умови електропорації розрізняються для різних видів бактерій. При роботі з Е.соlі клітинну суспензію і ДНК вносять у пробірку з електродом і подають одиничний імпульс струму тривалістю ~ 4,5мс. Після такої обробки ефективність трансформації підвищується до 10⁹ для коротких плазмід (приблизно 3 тис.п.н.) і до 10⁶ для великих плазмід (приблизно 100 тис.п.н.). Механізм проникнення ДНК шляхом електропорації не вивчений. Вважають, що як і за хімічної індукції трансформації в результаті електрошоку в клітинній стінці утворюються тимчасові отвори, через які ДНК проникає в клітину.

Рекомбінантні ДНК, побудовані на основі фагових векторів, проникають у клітини шляхом трансфекції. Більш ефективно передача фагових геномів досягається в тому випадку, коли вони попередньо упаковуються у фагові голівки in vitro, а потім вводяться в клітину за допомогою стандартної процедури інфікування. Дуже важливою вимогою у цьому випадку є здатність клітин адсорбувати і реплікувати бактеріофаг.

Генетична інженерія бактерій використовується для отримання як бактеріальних, так і еукаріотичних продуктів. До теперішнього часу не склалося чіткого уявлення про механізм впливу локальної структури ДНК на ефективність транскрипції генів. Не з’ясовані до кінця також причини нестабільності векторів і рекомбінантних ДНК в реціпієнтних клітинах. Часто нестабільним у бактеріальних клітинах є і сам чужорідний білок. Встановлено, що склад кодонів еукаріотичних генів не є оптимальним для їх експресії в бактеріальних клітинах. У зв’язку з цим приймаються заходи з оптимізації експресії чужорідних генів, тобто підбираються придатні промотори, оператори, термінатори транскрипції, сайти зв’язування рибосом, фізіологічні та інші умови. Добре налагоджена система експресії приводить до створення суперпродуцентів, в яких вихід чужорідного продукту може досягати 10-40% від сумарного білка. Найважливішими завданнями при культивуванні суперпродуцентів є підтримання їх стабільності і забезпечення секреції синтезованих ними продуктів.

Експресія генів є складним багатоетапним процесом, який залежить від багатьох факторів, що впливають на нього на різних рівнях – на рівні ДНК, мРНК або білка.

На рівні ДНК ефективність експресії залежить від сили промотору, наявності термінатора транскрипції, відсутності внутрішньогенних термінаторів транскрипції, кількості копій гена, суперспіралізації рекомбінантної ДНК, від розташування чужорідного гена відносно напряму руху реплікативної вилки.

На рівні РНК ефективність експресії чужорідного гена залежить від структури сайта зв’язування рибосом, стабільності транскрипта, наявності в мРНК оптимальних кодонів.

На рівні білка ефективність експресії залежить від стабільності поліпептида, його внутрішньоклітинної агрегації, можливості правильної модифікації чужорідного білка, включаючи його процесінг та здатність до секреції.

Ефективність експресії бактеріальних генів, якими трансформовані клітини Е. соlі, як правило, достатньо висока і залежить перш за все від швидкості транскрипції. Тобто, для забезпечення ефективної транскрипції достатньо розмістити чужорідний прокаріотичний ген під сильний промотор з високою спорідненістю до РНК – полімерази.

Що стосується експресії еукаріотичних генів, то вона в бактеріальних клітинах практично не здійснюється, якщо не створювати спеціальні умови, оскільки регуляторні ділянки генів еукаріотів відрізняються від таких у прокаріотів. По-перше, при генетичній модифікації бактерій геномною ДНК еукаріотів експресія генів не може відбуватися через відсутність у бактерій системи сплайсингу. З цієї причини для експресії еукаріотичного гена в прокаріотичній клітині використовується чи то кДНК, чи то синтетична ДНК. По-друге, у складі векторної молекули еукаріотичний структурний ген приєднується до бактеріальних регуляторних елементів, одним з яких є промотор. Наприклад, до складу вектора pBR322 входить промотор гена β-лактамази. Цей промотор, хоча і сильний, не є регульованим, а тому безперервна транскрипція з такого промотору призводить до інгібування росту бактерій. Доцільніше використовувати не лише сильні, але й регульовані промотори. Такі промотори можна включати за бажанням експериментатора тоді, коли вже накопичена достатня бактеріальна маса. Зокрема, до регульованих сильних промоторів відноситься промотор P^L з геному бактеріофага λ. Робота промотору P^L регулюється репресорним білком сІ цього бактеріофага. Для регуляції транскрипції використовується термочутлива форма промотору P^L, який забезпечує утворення репресорного білка сІ лише за низької температури. Трансформовані клітини, що містять мутантний промотор, спочатку вирощують при температурі 32°С. В цих умовах репресор утворюється і блокує транскрипцію з Р^L-промотору. ДНК реплікується, клітини інтенсивно діляться і, коли культура досягає потрібної фази (як правило, середини lag -фази), температуру підвищують до 42°С. При підвищеній температурі блокується утворення мутантного термочутливого репресорного білка. Промотор звільняється від репресора і розпочинається транскрипція та утворення продукту гена.

Наявність сильного регульованого промотору – дуже важлива, але недостатня умова отримання великої кількості продукту клонованого гена. Як вже зазначалося, важливу роль відіграють також ефективність трансляції та стабільність продукту. У прокаріотичних клітинах різні мРНК транслюються з різною ефективністю. Розбіжності можуть складати декілька сотень разів, а тому в клітині можуть міститися тисячі молекул одного білка і лише декілька копій інших білків.

Щоб забезпечити експресію еукаріотичного гена в бактеріальній клітині необхідно включати у вектор послідовність Шайна – Дальгарно.Ця послідовність є комплементарною до 3'-кінця 16S рРНК, вона складається з 5 - 9 нуклеотидів, ядром яких є послідовність AGGA. Цю послідовність розміщують безпосередньо перед ініціюючим кодоном AUG. У Е. соlі вона необхідна для приєднання мРНК до рибосоми, а тому визначає ефективність трансляції. Зміщення цієї послідовності в той чи інший бік призводить до зниження ефективності трансляції. Крім того, чим міцніше зв'язування між мРНК та рРНК, тим вища ефективність ініціації трансляції. Саме тому рекомбінантні ДНК реконструюють таким чином, щоб вони містили сайт зв'язування рибосоми - це необхідна умова трансляції гетерологічних про- і еукаріотних генів у клітинах Е. соlі.

Сумарна експресивна активність чужорідного гена залежить від кількості копій рекомбінантних ДНК на клітину. Використовуючи багатокопійні плазміди можна отримати надсинтез потрібного білкового продукту. Звичайні плазмідні вектори підтримуються у клітині у кількості 20 – 50 копій.

Однак, отримані температурочутливі мутантні плазміди, здатні копіюватися у кількості 1-2 тисячі на клітину без порушення життєво важливих функцій у бактерій.

Важливою умовою отримання великої кількості генно-інженерного білкового продукту є його стабільність.Для різних білків період напіврозпаду коливається від декількох хвилин до декількох годин. Така варіабельність обумовлена наявністю чи відсутністю міцних ковалентних дисульфідних зв'язків, які стабілізують структуру білка. Крім того, у забезпеченні стабілізації білків велику роль відіграє наявність на N- кінці молекули певних амінокислот. Амінокислоти, які здатні збільшувати стабілізацію білків, можуть бути включені в білки генно-інженерними методами.

Один з можливих підходів до стабілізації чужорідного білка в рекомбінантних клітинах полягає у використанні хазяйських штамів з дефіцитом протеолітичних ферментів. Однак, поки цей шлях є мало реальним, оскільки в клітині Е. соlі синтезується не менше 225 різних протеїназ, а характер генетичного контролю з’ясовано лише для декількох з них. Крім того, протеїнази виконують у клітинах дуже важливу функцію. Вони гідролізують чужорідні або ж дефектні білки і забезпечують життєздатність клітин. Незважаючи на ці проблеми, створені штами Е. соlі, які містять мутації у гені сигма–фактора РНК-полімерази, який відповідає за синтез білків теплового шоку, та в гені протеїнази, необхідної для росту клітин при високих температурах. Коли такі мутантні штами використовують в якості клітин-хазяїв для рекомбінантних ДНК, то синтезується у десятки разів більше чужорідного для цих клітин білка порівняно зі штамами дикого типу. Таке збільшення виходу продукту обумовлене зниженням інтенсивності протеолітичного розщеплення білків.

Одним із способів підвищення експресії чужорідних генів у хазяйських клітинах є інтенсифікація їх метаболізму за допомогою генно-інженерних маніпуляцій. Наприклад, виявлено, що бактерії роду Vitreoscilla, які здатні існувати в водоймах з низьким вмістом кисню, містять гемоглобіноподібний білок. Цей білок подібно гемоглобіну зв'язує кисень і збільшує концентрацію доступного кисню у клітині. Коли ген, що кодує даний білок, перемістили генно-інженерним шляхом у клітини Е. соlі, то у них відбулися значні зміни метаболізму, зокрема, підвищився синтез клітинних та рекомбінантних білків. Це обумовлено збільшенням концентрації кисню у клітинах Е. соlі, за рахунок чого забезпечується інтенсивний ріст клітин, незважаючи на погану розчинність кисню у водному середовищі.

Загалом, системи експресії досить різноманітні, а тому у кожному випадку необхідно підбирати найбільш оптимальні умови для отримання того чи іншого білка у тому чи іншому організмі-хазяїні.

Існує можливість ефективного клонування рекомбінантних ДНК в клітинах не тільки Е. соlі, а і інших видів бактерій. Одна з таких систем розробленана основі клітин Hemophilus influenzae та плазміди, виділеної з цього виду. Плазміда має розмір біля 6 тис.п.н., містить ген резистентності до ампіциліну та утворює численні копії в клітинах хазяїна. Оскільки Н. influenzae природно компетентна відносно трансформації, то трансформовані клітини отримують досить легко.

Якісні вектори отримані також для азотофіксуючої бактерії Klebsiella pneumoniae. Вони сконструйовані на основі бактеріофага Р4, який здатний розмножуватися як в клітинах Е.соlі, так і К. pneumoniae, а також, в залежності від умов, реплікуватися чи то як фаг, чи то як плазміда.

Для отримання великої кількості продукту клонованого гена використовують системи з Bacillus subtilis. Ці бактерії активно застосовують в генетичній інженерії для отримання продуцентів антибіотиків і ферментів. Ефективність використання В. subtilis обумовлена тим, що клітини цієї бактерії секретують в середовище синтезовані білки, а тому їх варто використовувати для виділення продуктів генів, привнесених рекомбінантними векторами. Як вектор використовується плазміда, отримана з грампозитивної бактерії Staphylococcus aureus. Її відрізняє те, що вона здатна реплікуватися в клітинах різних видів Bacillus. Створений на її основі вектор має розмір біля 5 тис.п.н. і містить два селективних маркери. Один з них надає клітинам резистентності до канаміцину, інший – необхідний для синтезу триптофану. При реплікації цього вектора в клітинах утворюється до 50 його копій на клітину. Клітини Bacillus трансформують навіть без використання спеціальних методичних прийомів. Але ефективність трансформації значно збільшується, коли замість інтактних клітин використовувати протопласти, отримані шляхом обробки клітин лізоцимом.

Отримано системи “хазяїн-вектор” на основігрампозитивних бактерій Streptomyces. Ці організми цікаві тим, що кодують переважну кількість антибіотиків, потрібних для медицини. Трансформанти на основі Streptomyces використовуються для створення продуцентів нових антибіотиків і підвищення їх ефективності.

Дата добавления: 2014-01-05