Окислительное фосфорилирование

Процесс переноса протонов и электронов по дыхательной цепи, локализованной во внутренней мембране митохондрий, к конечному акцептору электронов – молекулярному кислороду – сопровождается очень большим уменьшением свободной энергии. Иначе говоря, передвигаясь от одного переносчика электронов к другому, электроны опускаются на все более низкие энергетические уровни, отдавая порциями свою энергию.

Подсчитано, что при каждом переносе пары электронов с восстановленного пиридинпротеида (с НАД.Н₂) на кислород выделяется 52,12 ккал (218,2 кДж) энергии.

При сопоставлении этой величины с величиной стандартной свободной энергии образования АТФ из АДФ и фосфата, равной 7,3 ккал (30,4 кДж) очевидно, что уменьшение свободной энергии при переносе одной пары электронов от НАД.Н₂ на кислород достаточно велико для того, чтобы обеспечить возможность образования нескольких молекул АТФ из АДФ и фосфата при условии наличия соответствующего механизма сопряжения фосфорилирования АДФ с окислительным процессом в дыхательной цепи.

При рассмотрении энергетики дыхательной цепи оказалось, что в дыхательной цепи имеются три участка, в которых перенос электронов сопровождается относительно большим изменением стандартной свободной энергии (т.е. высвобождением энергии), превышающим величину стандартной свободной энергии образования АТФ из АДФ и фосфата. Такими участками явились: участок между флавопротеидом и КоQ, участок между цитохромом «в» и цитохромом «с» и участок между цитохромом «а» и цитохромом «а₃». Уменьшение свободной энергии на этих участках составляет 9,9-23,8 ккал (40-99,6 кДж), что значительно превышает величину стандартной свободной энергии образования АТФ из АДФ и фосфата, равную 7,3 ккал (30,4 кДж). В других участках дыхательной цепи уменьшение свободной энергии не столь выражено и, по-видимому, не может обеспечить образование молекулы АТФ.

Таким образом, митохондриальная дыхательная цепь напоминает каскадное устройство, поставляющее клетке свободную энергию определёнными порциями.

Идея о наличии сопряжения фосфорилирования АДФ и тканевого дыхания впервые была высказана советским ученым В.А. Энгельгардтом в начале 30-х годов. Впоследствии исследованиями В.А. Белицера, Очоа, Лумис и Липман, Кеннеди и Ленинджера, Митчела, С.Е. Северина, В.П. Скулачева и др. была в значительной мере раскрыта сущность этого процесса.

Установлено, что сопряжёно с передачей протонов и электронов по окислительно-восстановительной цепи ферментов осуществляется важнейший для жизнедеятельности организмов процесс-синтез атф из АДФ и Н₃РО₄, т.е. высвобождающаяся при тканевом дыхании энергия трансформируется в энергию фосфатной связи АТФ. Этот процесс получил название «окислитель­ное фосфорилирование» и служит для аккумуляции в макроэргических связях АТФ около 40% всей энергии, освобождающейся в процессе тканевого дыхания.

При окислительном фосфорилировании с помощью дыхательной цепи и сопряжено с транспортом протонов и электронов по всей цепи происходит активирование неорганического фосфата и передача его затем на АДФ с образованием АТФ.

Активирование фосфата происходит на описанных выше трех участках митохондриальной дыхательной цепи, характеризующихся повышенным высвобождением свободной энергии.

В случае окисления субстратов пиридиновых дегидрогеназ и восстановленных пиридинпротеидов на каждую пару атомов водорода, поступившую в дыхательную цепь и окислившихся до Н₂О, синтезируется три молекулы АТФ, что связано с указанными тремя участками активирования неорганического фосфата и синтезом на каждом из них АТФ из АДФ и активированного фосфата. В случае окисления субстратов флавиновых ферментов (например, янтарной кислоты) и восстановленных флавопротеидов образуется 2 молекулы АТФ, что объясняется выпадением первого участка активирования (участка между флавопротеидом и КоQ).

Величина фосфорилирования выражается показателем эффективности окислительного фосфорилирования, характеризующегося отношением:

Это отношение, называемое коэффициентом фосфорилирования и обозначаемое как Р/O, оказывается различным в зависимости от подвергающегося окислению субстрата и способа получения митохондрий. Для истинного фосфорилирования, обусловленного реакциями в дыхательной цепи, отношение Р/О равняется 3 (в этом случае происходит окисление восстановленного НАД и субстратов НАД-дегидрогеназы) и 2 (в этом случае происходит окисление восстановленных флавопротеидов и субстратов флавиновых ферментов).

Процесс окислительного фосфорилирования протекает внутри митохондрий – субклеточных частичках специфического строения. В клетках их может находиться от нескольких сотен до нескольких десятков тысяч. Характерной особенностью строения митохондрий является наличие у них двух мембран, из которых внутренняя имеет большую протяженность и образует выпячивания (кристы), погруженные во внутреннее основное вещество митохондрий, называемое матриксом. Толщина наружной мембраны составляет приблизительно 7,0 нм, а внутренней мембраны – 5,0-5,5 нм.

Внутренняя поверхность внутренней мембраны покрыта расположенными в определенном порядке частицами сферической формы (диаметром 8,0-9,0 нм), получивших название элементарных структурных единиц.

Мембраны состоят из липидов (1/3 часть) и белков (2/3 части), матрикс представляет собой студнеобразную, полужидкую массу, состоящую приблизительно на 50% из белка. Около 20-25% общего белка внутренней мембраны составляют белки ферментов, участвующих в образовании дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования, тогда как остальные белки являются структурными.

Дыхательные ансамбли, состоящие из флавопротеидов, убихинона, железосерных белков и цитохромов, располагаются в плоскости внутренней мембраны митохондрий в основании элементарных структурных единиц, которые представляют собой, по современным воззрениям, АТФ-азную систему (АТФ‑синтетазу), включающую два особых белковых комплекса F₁ – F₀ (факторы сопряжения), обеспечивающие фосфорилирование АДФ в АТФ в процессе переноса электронов по дыхательной цепи. Дыхательные ансамбли равномерно распределены по плоскости внутренней мембраны. F₀-комплекс (фактор) состоит из 4-х субъединиц, которые пронизывают мембрану поперек, ответственен за перенос Н⁺. F₁-комплекс (фактор) связан с F₀ и состоит из 9-10 субъединиц 5-ти типов, образует грибовидный выступ на мембране, непосредственно ответственнен за синтез АТФ.

Внутри митохондрий, кроме ферментов дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования, находятся также ферменты лимоннокислого цикла, окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты, β‑окисления жирных кислот, орнитинового цикла и др.

Реакции лимоннокислого цикла, процессы переноса электронов по дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования происходят внутри митохондрий или на внутренней поверхности внутренней мембраны. Поэтому молекулы фосфата, АДФ, субстраты лимоннокислого цикла и тканевого дыхания, прежде чем подвергнуться окислению, должны сначала проникнуть внутрь митохондрий. Однако внутренняя мембрана непроницаема для катионов Na⁺, К⁺, Мg⁺, анионов С1^-, Вr^-, NO₃^-, Н⁺, сахаров (таких как сахароза), большинства аминокислот, окисленных и восстановленных НАД и НАДФ, нуклеозид-5-моно-, ди- и трифосфатов (в том числе АДФ и АТФ), коэнзима А и его эфиров.

Внутренняя мембрана проницаема только для воды, для небольших нейтральных молекул, таких как мочевина и глицерин, для жирных кислот с короткой цепью.

Оказалось, что для переноса специфических метаболитов через мембрану внутренняя мембрана содержит несколько ферментоподобных соединений (пермеаз или транслоказ). Такие переносчики идентифицированы для АДФ и АТФ, для фосфата и для некоторых промежуточных продуктов лимоннокислого цикла (сукцината, малата, изоцитрата, цитрата, цис-аконитата), а также для глутамата и аспартата.

Благодаря этим переносчикам осуществляется сложный двусторонний обмен промежуточными продуктами лимоннокислого цикла, фосфатом, АДФ и АТФ между цитоплазмой и внутренним отделением митохондрий. В частности, благодаря функционированию АДФ‑АТФ‑переносчика, требуемое для окислительного фосфорилирования количество АДФ входит внутрь митохондрий через внутреннюю мембрану, а одновременно эквимолекулярное количество АТФ выходит из нее в цитоплазму.

Протоны и электроны цитоплазматического НАД.Н₂ (образовавшегося, к примеру, на окислительной стадии расщепления глюкозы в цитоплазме) могут поступать внутрь митохондрий непрямым путем, без переноса самих молекул НАД. Это осуществляется с помощью глицерофосфатного или малатного челночного механизма. Предполагают, что существует также лактатный челночный механизм.

Аналогичный механизм осуществляется для перемещения протонов и электронов из митохондрий в цитоплазму (что происходит, к примеру, при биосинтезе глюкозы из пирувата в цитоплазме).

Сущность глицерофосфатного челночного механизма сводится к следующему. Цитоплазматический НАД.Н₂ сначала реагирует с цитоплазматическим фосфодиоксиацетоном (одним из промежуточных продуктов гликолиза), образуя глицерофосфат. Эта реакция катализируется НАД-зависимой цитоплазматической глицерофосфатдегидрогеназой.

Образовавшийся глицерофосфат способен легко проникать через митохондриальные мембраны внутрь митохондрий, где внутримитохондриальная флавин-зависимая глицерофосфатдегидрогеназа снова окисляет глицерофосфат до фосфодиоксиацетона:

Восстановленный флавопротеид вводит приобретенные им электроны в дыхательную цепь(наКоQ), обеспечивая окислительное фосфорилирование двух молекул АДФ, а фосфодиоксиацетон выходит из митохондрий в цитоплазму, где снова может служит акцептором электронов для новой молекулы цитоплазматического НАД.Н₂. Высказывается также мнение: окисление ФП.Н₂ не приводит к образованию 2 молекул АТФ, а приводит к высвобождению энергии в виде тепла.

Малатный челночный механизм включает систему промежуточных соединений: оксалоацетат – малат. Цитоплазматический НАД.Н₂ сначала реагирует с оксалоацетатом при участии цитоплазматической малатдегидрогеназы, образовавшийся малат с помощью транслоказы переносится внутрь митохондрий, где под влиянием митохондриальной дегидрогеназы дегидрируется. Образовавшийся НАД.Н₂ окисляется флавопротеидом дыхательной цепи митохондрий, путем окислительного фосфорилирования образуется три молекулы АТФ. Полагают, что малатный челночный механизм является наиболее активным механизмом переноса восстановительных эквивалентов из цитоплазмы в митохондрии.

Для объяснения механизма окислительного фосфорилирования существует три гипотезы, а именно: гипотеза химического сопряжения, гипотеза хеми-осмотического сопряжения и гипотеза механохимического или конформационного сопряжения окисления и фосфорилирования.

В настоящее время наиболее серьезное обоснование получила гипотеза хеми-осмотического сопряжения, предложенная Митчелом в 1961 году и получившая развитие в исследованиях советского ученого В.П. Скулачева (1972 г.). В 1978 г. Митчелу за разработку хеми-осмотической гипотезы была присуждена Нобелевская премия.

Исходя из того, что митохондриальная мембрана является существенным элементом механизма окислительного фосфорилирования и что она непроницаема для ионов водорода (Н⁺), согласно хемиосмотической гипотезы предполагается, что при тканевом дыхании в процессе движения электронов вдоль дыхательной цепи каждая пара электронов, поставляемая НАД.Н₂, трижды пересекает внутреннюю мембрану митохондрий, каждый раз захватывая пару протонов из матрикса и в итоге переносит три пары протонов из внутренней части митохондрий (матрикс) через мембрану наружу (в межмембранное пространство). В результате транслокации протонов через мембрану на внутренней мембране возникает протонный градиент (электронно-химический потенциал), представляющий собой форму запасания свободной энергии. Общая энергия протонного градиента складывается из концентрационного (или осмотического) компонента, определяемого разницей рН по обеим сторонам мембраны, и электрического компонента, обусловленного движением положительно заряженных протонов через мембрану (разница рН примерно =1,4 единицы, электрический потенциал – около 140 мВ.). Из-за разницы в концентрационном и электрическом потенциале протоны, вынесенные из митохондрий, стремятся пересечь мембрану в обратном направлении. Обратное движение протонов через мембрану (через протонные каналы – белок Fо) под влиянием протонного градиента сопряжено с фосфорилированием, или иначе способно привести к работе, такой как фосфорилирование: АДФ+Ф®АТФ+НОН. Предполагается, что два протона, переносимые с помощью белкового комплекса Fо через мембрану (через протонный канал), взаимодействуют с одним из кислородов (или ОН-групп) фосфата, связанного с белковым комплексом F₁ ферментной системы F₁ – F₀ АТФ‑синтетазы, что приводит к высвобождению кислорода с образованием воды и делает фосфатную группу высокореактивной и способной связываться с АДФ с образованием АТФ. Установлено, что на каждые два протона, пересекающих комплекс F₁ – F₀ образуется одна молекула АТФ из АДФ и активированного описанным способом неорганического фосфата.

Характерная особенность рассмотренной хеми-осмотической гипотезы состоит в том, что образование АТФ в процессе окислительного фосфорилирования происходит без участия высокоэнергетических промежуточных продуктов. Роль промежуточного звена, движущей силой процесса служит электрохимический потенциал (протонный градиент), возникающий на мембране митохондрий за счет энергии, выделяемой в процессе переноса электронов по дыхательной цепи. Согласно наблюдениям В.П. Скулачева, в процессе дыхания на мембране митохондрий, хлоропластов и бактерий действительно возникает мембранный потенциал, достаточный для энергетического обеспечения реакции синтеза АТФ из АДФ и фосфата.

Не следует думать, что любое окисление органических соединений в живых организмах сопряжено с фосфорилированием, так же как и фосфорилирование не обязательно должно быть окислительным. В настоящее время известно несколько сот реакций окисления, но менее десятка их сопряжено с одновременным активированием неорганического фосфата.

Кроме окислительного фосфорилирования различают также субстратное, фотосинтетическое (растения), хемосинтетическое (микроорганизмы) фосфорилирование.

Объем окислительного фосфорилирования в значительной мере зависит от проницаемости мембраны митохондрий. Митохондриальная мембрана может пропускать внутрь митохондрий посредством глицерофосфатного или малатного челночного механизма большее или меньшее количество восстановительных эквивалентов с цитоплазматической НАД.Н₂, которые включаются здесь в процессы окислительного фосфорилирования, тогда как на поверхности митохондрий в цитоплазме НАД.Н₂ окисляется свободно, при этом не образуется АТФ, а выделяющаяся энергия превращается в тепло. Однако и внутри митохондрий может произойти переключение с окисления, сопряженного с фосфорилированием, на свободное окисление (и обратно), сопровождаемое образованием тепла. Это происходит при разобщении переноса электронов и фосфорилирования в дыхательной цепи, что может произойти, в частности, при понижении температуры или воздействии некоторых химических липофильных веществ (замещенных фенолов, к примеру, 2,4-динитрофенола, а так же свободных жирных кислот, фенилгидразонов, грамицидина, арсената, дикумарола, тироксина и др.). Их назвали ионофорами. Следует заметить, что действие химических разобщителей (так называемых протонофоров или ионофоров), способных нивелировать протонный градиент путем переноса протонов через мембрану митохондрий в обратном направлении – в матрикс, минуя протонный канал, послужило важным доказательством хеми-осмоти­ческой гипотезы сопряжения фосфорилирования и тканевого дыхания. Значительные исследования в этой области были выполнены В.П. Скулачёвым.

Интенсивность окислительного фосфорилирования регулируется соотношением в клетке содержания АТФ, с одной стороны, и АДФ и неорганического фосфата, с другой. Причем, два последних вещества активируют процесс окислительного фосфорилирования. При усилении распада АТФ на АДФ и Н₃РО₄ в процессе реакций, идущих с потреблением энергии, и накопления последних в клеточном содержимом, автоматически усиливается окислительное фосфорилирование, т.е. биосинтез АТФ.

Дата добавления: 2014-01-05