Активація росту пагонів

Експланти, їх походження і введення в культуру

Етапи мікроклонального розмноження рослин

Технологія мікроклонального розмноження рослин складається з таких основних етапів:

1. Відбір експлантів і введення їх в культуру

2. Активація розвитку пагонів з експланту

3. Укорінення пагонів

4. Переведення отриманих рослин із стерильних умов у ґрунт, їх адаптація (тобто з умов ін вітро в умови ін віво).

Термін «експлант» застосовують для назви вихідного шматочка рослини, який вводять в культуру ін вітро. В якості експлантів використовують верхівки пагонів, бокові бруньки, частини кореня або листка, черешок листка, суцвіття, пелюстки квітів, гіпокотиль проростаю чого насіння та інші частини рослини.

Для успішного проведення робіт з регенерації рослин вибір експлантів відіграє першорядне значення. Краще всього використовувати матеріал, вилучений із здорових, сильних рослин. Вибір експлантат залежить від виду, стану рослини-донора (фази її розвитку), сезону року. Значення має навіть положення експлантат на рослині. Так, верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева, мають більшу швидкість розмноження, ніж верхівки з нижніх гілок.

Більшість експлантів добре вводяться в культуру у фазі активного росту донорської рослини. Проте є рослини, експланти з яких утворюють пагони лише в стані спокою. Незрілі, молоді органи завжди більш пластичні з точки зору здатності до морфогенезу ін вітро, ніж старіючі, зрілі тканини та органи. Більше того, при виборі експлантів слід віддавати перевагу меристематичним тканинам, оскільки вони легше виживають в культурі, мають більшу швидкість росту і тотипотентність. Розмір експлантат теж визначає ступінь виживання ін вітро (крупніші за розміром верхівки пагона завжди краще виживають).

Донорські рослини, з яких збираються вилучити експланти, вирощують у якомога чистому середовищі, уникають надмірного поливання, забруднення пагонів і листків. Важливими компонентами успіху є очистка і стерилізація рослинного матеріалу перед введенням його в культуру ін вітро.

Таким чином, відібраний і простерилізований експлант вводиться в культуру на спеціальне поживне середовище.

Всі рослини ростуть завдяки активності їх верхівкових меристем (рис.). Такі меристематичні тканини знаходяться на кінчику основного пагона, в пазухових бруньках, зародку – класичних експлантат для мікроклонального розмноження рослин.

Брунька – це зачатковий, нерозвинений пагін з дуже вкороченими міжвузлями (рис.).

Рис. Схема поздовжнього розрізу бруньки насінних рослин:

1 – конус наростання; 2 – листковий примордій; 3 – зачатки пазушних бруньок

Вона складається з меристематичної зачаткової осі, яка закінчується конусом наростання. Нижче конуса закладаються зачатки листків, різні за віком і розмірами. Листки розташовані в бруньці один над одним. В пазухах зачаткових листків (примордіїв) утворюються горбочки – зачатки бічних (пазушних) бруньок. Отже, вегетативні бруньки можуть бути верхів очними (апікальними) і пазушними (розташованими в пазухах листків або брунькових лусочок).

Поняття апекс і конус наростання не можна ототожнювати. Пояснюється це тим, що під конусом наростання розуміють лише верхню (часто конусоподібну) частину апекса, де немає листкових зачатків (вище примордіальної зони) апекса. Тобто під апексом мається на увазі цілий комплекс меристематичних клітин з різними функціями.

Апекс – частина бруньки, ростовий центр пагона. Завдяки діяльності його клітин формуються первинні тканини і зачатки всіх органів (вісь, листки та бруньки), тобто йому властиві як гістогенні, так і органогенні процеси.

Таким чином, якщо наш експлант – верхівка пагона розміром 0,25-0,30 мм завдовжки, то в пазухах його зачаткових листочків знаходяться додаткові меристематичні тканини, які здатні формувати нові пагони. Розвиток всіх пазухових пагонів гальмується апікальним домінуванням. Дія підвищених концентрацій цитокінінів на відокремлений від рослини експлант долає ефект апікального домінування в умовах ін вітро і призводить до росту цілого пучка пагонів першого, другого, третього і т.д. порядків. Цей процес називається проліферацією пагонів ін вітро. Утворені пагони знову пересаджуються на те саме поживне середовище для подальшого отримання нових пагонів з його пазухових бруньок. Подібний процес можна продовжувати і отримувати велику кількість пагонів за відносно короткий період часу.

Метод проліферації пазухових пагонів з апексів або бруньок є найбільш поширеним у практиці мікроклонального розмноження різних видів рослин. При утворенні пагонів поживне середовище повинно містити цитокінінів більше, ніж ауксинів. Це «золоте правило» пагоноутворення має винятки для деяких видів рослин. В культурі ін вітро використовують такі цитокініни: кінетин, зеатин, БАП; ауксини: ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д. Співвідношення цитокінін/ауксин підбирається для кожної культури експериментально.

Важливе значення для активації формування пагонів мають умови освітлення і температури. Світло необхідне для морфогенезу і утворення хлорофілу. Використовують, як правило, люмінесцентні лампи з інтенсивністю світла 1000-1500 люкс. Оптимальним періодом освітленості для більшості рослин вважають проміжок часу 16 годин, хоча для деяких рослин враховують ефект фотоперіодичності. Температура 20-25^оС визнається оптимальною для росту пагонів рослин зони помірного клімату.

Існує метод отримання пагонів з калусної тканини, який теж відноситься до мікроклонального розмноження, але мало застосовується, тому що може призводити до генетичних змін у новостворених рослин-регенерантів. Ця важлива особливість регенерації через калусну тканину буде розглянута при викладенні питань соматичного ембріоїдогенезу.

Дата добавления: 2014-01-07