Исследовательская работа

Материалы и методика

2.1. Этические аспекты исследовательской работы

Эксперименты на животных проводились в соответствии с требованиями стандартов DIN EN ISO 10993-2:2006. Исследования с участием животных были утверждены Бюро по ветеринарии и продовольствию Федеральной земли Мекленбург-Передняя Померания (LVL M-V/TSD/7221.3-2.1). Два пациента, принявших участие в данном исследовании, подписали информационное согласие; процедуры проводились в соответствии с Хельсинской декларацией. Для целей клинических испытаний было также получено согласие экспертного совета (клиники "Poliambulatoriodel Secondo Parere", Модена, Италия).

2.2. Подготовка гидрогеля на основе перекрестно связанной ГК

3% раствор ГК был подготовлен путем растворения 66г гиалуроната натрия (1× 106 Da, Kräber GmbH & Co., Эллербек, Германия) в 2000мл 0,05 моль/л NaOH при комнатной температуре. После полного растворения DVS (≥98%; Sigma-Aldrich, Германия) был введен раствор ГК для целей образования межмолекулярных перекрестных связей с гидроксильными группами ГК. Была получена большая масса гелеобразной ГК, которая была разбита на гелевые частицы (∼150μ; Технология монофазных частиц [MPT]). Для устранения непрореагировавшего реагента проведена промывка гелеобразной ГК. В итоге шприцы были наполнены гелеобразными частицами ГК.

Рис. 3.(A) Крыса тестовой группы (6месяцев после инъекции). Отложение геля поверх кожной мышцы и узкого капсульного образования. Слева видна подкожная жировая ткань между кожной мышцей и кожей. Слабовыраженный фиброз (В) Крыса сателлитной группы (6 месяцев после инъекции). Капсула вокруг отложения геля с островками геля поверх кожной мышцы Заметен фиброз от слабо выраженного к умеренному. (C) Крыса сателлитной группы (6 месяцев после инъекции). Капсула вокруг отложения геля с островками геля. CM = кожная мышца; BL = крайний слой; GC = гигантские клетки. Окраска гематоксилином и эозином.

3.1. Пульсирующий сдвиг малой амплитуды

Вязкоэластичные свойства гелеобразной ГК можно определить путем проведения реологического исследования. Реология базируется на соотношении деформации материала и прилагаемого давления, а также рассматривает текучесть веществ. Пульсирующий сдвиг малой амплитуды (ПСМА) - один из реологических методов по определению вязкоэластичных свойств материала. В соответствии с реологическими принципами, описание вязкоэластичных свойств гелеобразной ГК можно выявить путем оценки модуля эластичности G' (G прайм), и модуля вязкости G" (G дабл прайм) при помощи реометра. Степень модификации, количество перекрестно связанной и свободной ГК, а также степень гидратации влияют на реологические свойства гелеобразной ГК. Соотношение между модулем вязкости и модулем эластичности соответствует тангенсу угла потерь tanδ (tanδ = G"/G'). Если tanδ больше 1, то материал более вязкий, а если меньше, то материал более эластичный. Концентрация ГК, степень межмолекулярных перекрестных связей ГК, количество свободной ГК и процесс производства влияют на твердость получаемого геля, измеряемую G'. В нашем исследовании реологические измерения производились с использованием реометра HAAKE RheoStress 1 (Thermo Fischer Scientific, Process Instruments, Карлсруэ, Германия). Реологические свойства Variofill® рассматривались в режиме ПСМА с учетом геометрии плоскости 35 мм и интервала в 1 мм при температуре 20^oC.

3.2. Исследование имплантата

Исследование имплантата проводилось в соответствии с требованиями DIN EN ISO 10993-6: 2009. Исследование было направленно на изучение локального эффекта тестируемого материала (Variofill®), который был введен подкожно в спину крысы, и который сравнивался с контрольным материалом, состоящим из 0,3% агарозы (NEEO Ultra-Quality, Carl-Roth, Дармштадт, Германия). Такое исследование проводилось в установленном порядке для целей изучения локального эффекта имплантата на ткани животного на макроскопическом и микроскопическом уровнях (DIN ENISO 10993-6: 2009; Martinetal., 1990; Rusieckietal., 2004).

3.3. Подготовка животных

Исследование проводилось на 30 половозрелых крысах-самках линии Вистар в возрасте 7 недель с исходной массой тела 176 - 200 г. В помещении, в котором содержались животные, поддерживалась температура воздуха на уровне 18±3 ◦C при влажности 60±20%, и обеспечивался суточный цикл освещенности с чередованием 12-часовых периодов света и темноты. Животным был обеспечен неограниченный доступ к пище и воде.

Крыс разделили на 3 группы: для крыс первой группы (n=10) была выполнена инъекция 0,25 мл Variofill® (тестируемая группа), для крыс второй группы (n=10) - инъекция 1 мл Variofill® (сателлитная группа); для крыс третьей группы (n=10) - инъекция 0,25 мл 0,3% агарозы (контрольная группа). Все инъекции выполнялись в стерильных условиях одним и тем же исполнителем в ходе всего исследования. Контрольный раствор был подготовлен путем растворения агарозы в натрий-фосфатном буфере (Phosphatebufferedsaline, PBS), выбранный ввиду своей нетоксичности и консистенции, схожей с Variofill®. После введения препарата Variofill® две крысы из каждой группы подвергались эвтаназии при помощи брюшной инъекции диэтилового эфира (Карл Рот, Дармштадт, Германия) по истечение 6, 9,12, 15, и 18 месяцев. Образцы кожи, вокруг имплантата, собирались для макроскопической и микроскопической оценки. Для данных целей имплантаты боковых зон, а также некоторые нетронутые участки, начиная с глубокого мышечного слоя до уровня кожи, были исключены.

3.4. Макропатология и гистология

Изучение макропатололии участка имплантата, сфотографированного после введения материалов и до эвтаназии крыс, проведено в соответствии с научной групповой работой ЫнДжу О в соавторстве с другими учеными (Eun Ju Ohetal.). Эвтаназия крыс проводилась при помощи 0,2 мл 2% ксилазина (Serumwerk Bernburg AG, Бернбург, Германия). Для гистологического анализа образцы ткани сначала фиксировались в 4% нейтральном буферном растворе формалина, затем заливались парафином и окрашивались гематоксилином (Merck, Дармштадт, Германия) и эозином (Fa.Applichem, Дармштадт, Германия) в соответствии с нашими предыдущими исследованиями.

(При помощи аксиоскопа A1 компании Carl Zeiss GmbH Microlmaging, Гёттинген, Германия) был проведен макроскопический анализ участка имплантата и нетронутых зон. Измерялись отложения геля малого и большого диаметров. Степень фиброза классифицировались как минимальная, от минимальной к слабо выраженной, слабо выраженная, от слабо выраженной к умеренной, и умеренная.

Рис 4. (A) Крыса тестовой группы (9 месяцев после инъекции). Отложение геля и капсула вокруг отложений геля. Гелеобразная ГК хорошо интегрировала с дермальной тканью (В) Крыса тестовой группы (9 месяцев после инъекции). Капсула вокруг отложений геля. Степень фиброза от слабо выраженной к умеренной, а также слабо выраженная инфильтрация воспалительных клеток (C) Крыса тестовой группы (9 месяцев после инъекции). Нормальный нетронутый участок кожи. Нормальная соединительная ткань по кожной мышцей (D) Крыса тестовой группы (9 месяцев после инъекции). Отложение геля и толстая часть капсулы вокруг отложений геля. Виден умеренный фиброз (E) Крыса сателлитной группы(9 месяцев после инъекции). Разрез капсулы вокруг отложений геля. Слабо выраженный фиброз и слабо выраженная инфильтрация воспалительных клеток. (F) Крыса сателлитной группы (9 месяцев после инъекции). Капсула вокруг отложений геля. В некоторой степени плотная инфильтрация воспалительных клеток (макрофаги и гигантские клетки) заметна в крайнем слое. GD = отложение геля; GDC = капсула отложений геля; FT = жировая ткань; CT = соединительная ткань; CM = кожная мышца. Окраска гематоксилином и эозином.

Дата добавления: 2015-05-08