Результаты. Клинические испытания

Клинические испытания

4.1. Пацинеты

Два пациента, принявших участие в настоящем исследовании, проходили лечение в больнице “Poliambulatoriodel Secondo Parere” (Модена, Италия). На лице пациента № 1 были видны травматические шрамы, искажающие его лицо. У пациента № 2 наблюдалась большая послеоперационная грыжа передней брюшной стенки. В обоих случаях для проведения медицинских процедур был задействован препарат Variofill®.

4.2. Гистологический анализ

Кожные лоскуты круглой формы (2 мм) с участка, в который была введена гелеобразная ГК, были взяты при помощи дерматома. Образцы ткани зафиксировали в 10% растворе формалина (Sigma–Aldrich, Милан, Италия) на 48 часов при комнатной температуре. Парафиновая обработка ткани производилась в следующем порядке: (1) обезвоживание 70% этанолом (Sigma–Aldrich, Милан, Италия) в течение 20 мин; (2) обезвоживание 95% этанолом в течение 20 мин (дважды); (3) обезвоживание 100% этанолом в течение 20 мин (дважды); (4) выдержка в ксилене (Sigma–Aldrich, Милан, Италия) в течение 1 часа; (5) выдержка в парафине (65оС, Sigma–Aldrich, Милан, Италия) в течение 1 часа; (6) выдержка в парафине (65оС) в условиях вакуума в течение 1 часа. Полученные блоки для нарезки лицевой стороной были помещены на лед на 10 минут, и затем разрезаны при помощи замораживающего микротома. Депарафинизация и обработка гистологических срезов производились в следующем порядке: 10 минут в ксилене; 2 минуты в 50% этаноле, и 2 минуты в дистиллированной воде. Затем срезы поместилина 10 минут в 1% растворальцианового синего красителя (Alcian Blue 8GX; Sigma–Aldrich, Милан, Италия), растворенного в 0,8% уксусной кислоте, и после чего промывались под проточной водой в течение 10 минут. В итоге они были помещены на 5 минут в раствор ядерного прочного красного (Sigma–Aldrich, Милан, Италия). Срезы были обезвожены и помещены в заливочную среду (Poly-mount, PolysciencesInc., Уоррингтон, США).

5.1. Реологические свойства

Оценка вязкоэластичных свойств Variofill® производилась методом пульсирующего сдвига. Эластичные и вязкие свойства Variofill® на разных частотах приведены на Рисунке 1. Модуль эластичности Variofill® (обозначенный G') равен 2850Па, и модуль вязкости Variofill® (обозначенный G") равен 567Па; тангенс угла потерь tan (δ) равен 0,20 при частоте 0,63 рад/сек.

5.2. Макроскопические данные

На осмотре по истечении 15 и 18 месяцев отложения геля у крыс тестовой и сателлитной групп показаны на рис. 2 A-D. Отложения геля не были обнаружены у крыс контрольной группы. На протяжении всего исследования ни у одной из групп аномальных признаков в нетронутых участках вокруг зоны имплантата зафиксировано не было. Образец нормального нетронутого участка кожи крысы из тестовой группы взят по истечении 9 месяцев и представлен на рис.4 С.

5.3. Гистологический анализ

Размеры отложений препарата Variofill® уменьшались на протяжении всего исследования вследствие биологической деградации. Отмечена различная толщина отложений геля у разных крыс, а также образование капсульного слоя (Рис. 4A, D, 5A–B, 6A–D). Обнаружено незначительное количество базофильных частиц геля вблизи капсульного слоя. Данный слой состоит из фиброзного каркаса, который различается по плотности и толщине, а также включает небольшие островки геля (Рис. 3B–C, 6B, D, 7B–C и8A). Вблизи внутреннего большого отложения геля находится фиброзный промежуточный слой (толщина которого отличается от слайда к слайду). Внешнюю сторону капсульного слоя окружает соединительная ткань разной толщины. Общий объем фиброза представлен объединением и слиянием внешней соединительной ткани в общие трабекулярные нити внутреннего тонкого коллагенового промежуточного слоя и мезенхимальной реакцией вокруг стойких отложений геля. В таблице 1 указана степень фиброза и инфильтрации воспалительных клеток у животных тестовой и сателлитной групп по истечении 6 (Рис. 3A–B), 9 (Рис. 4B, D–F и5A–B), 12(Рис. 6B–D), 15 (Рис. 7B–C) и 18 (Fig. 8A–C) месяцев с момента проведения инъекции.

Тестовая группа. У животных группы, для которой проводились инъекции в малых дозах, гистологический анализ по истечении 6 месяцев показал наличие множественных метахроматических вакуолей ГК в дермальной строме поверх кожной мышцы(Рис. 3A). На осмотре по истечении 9 месяцев было отмечено, что гелеобразная ГК хорошо интегрировала с дермальной тканью (Рис. 4A). В окружающих участках был замечен фиброз от слабо выраженного к умеренному в области нетронутой коллагеновой сетки, а также слабо выраженная инфильтрация воспалительных клеток (Рис. 4В).Отложения гелеобразной ГК были отмечены по истечении 12 месяцев в мышечных волокнах без вреда для мышечной структуры (Рис. 6В). В этих глубоких очагах было также обнаружено умеренное слияние поперечно-связанной ГК в большие накопления со слабо выраженными или умеренными коллагеновыми волокнами, окружающими данные участки (Рис. 6В). По истечение 15 месяцев было также отмечено наличие подкожного накопления гелеобразной ГК между мышцами и подкожными прилегающими органами с признаками процесса всасывания биоматериала, однако, среди кластеров жировых клеток все еще наблюдается присутствие остатков гелеобразной ГК (Рис. 7А).В итоге, по истечении 18 месяцев гелеобразная ГК частично биодеградировала, и объединилась в метахроматические вакуоли, окруженные пучками волокон, а также наличие только слабо выраженной инфильтрации воспалительных клеток (Рис. 8А).

Сателлитная группа. Группа, для которой проводились инъекции в больших дозах, гистологический анализ по истечении 6 месяцев показал, что биоматериал был окружен умеренными коллагеновыми волокнами с небольшими количествами проколлаген-продуцирующих фибробластов(Рис. 3С).На осмотре по истечении 9 месяцев было отмечено присутствие гелеобразной ГК со слабо выраженной неоднородной прослойкой в дерме и мышечной фасции (Рис. 5A), а также со слабо выраженной или отсутствующей инфильтрацией воспалительных клеток (Рисунки 4Е и 5В). По истечении 12 месяцев нити ГК образовали слой между глубокой дермой и гиподермой, а также был заметен слабо выраженный фиброз и инфильтрация воспалительных клеток (Рис. 6D). По истечении 15 месяцев остатки гелеобразной ГК слились в вакуоли большего диаметра (50–60μm) с образованием умеренной капсульной реакции вокруг первоначально введенного объема гелеобразной ГК (Рис. 7B). Кроме того, остатки гелеобразной ГК переплелись с развитыми фибробластами (Рис. 7B).

Рис. 5. Крыса сателлитной группы (9 месяцев после инъекции). (A) Тонкая капсула в дермальном пространстве, и очень тонкая под эпидермисом. Слабо выраженный фиброз. (B) Воспалительная реакция отсутствует; видны скудные коллагеновые нити по всей ретикулярной строме. CM = кожная мышца. GDC = капсула вокруг отложений геля. Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 6. (A) Крыса тестовой группы(12 месяцев после инъекции). Отложения геля, окруженные очень тонкой капсулой и двумя слоями от очень тонкого к умерено толстому, разместились разными пластами в слое дермы. Виден узкий промежуток между слоями. (B) Крыса тестовой группы (12месяцевпослеинъекции). Разрез очень тонкой капсулы вокруг отложения геля со слабо выраженным фиброзом и минимальной инфильтрацией воспалительных клеток. (C) Крыса тестовой группы (12 месяцев после инъекции). Участок очень тонкой капсулы вокруг отложения геля. Виден минимальный фиброз. (D) Крыса сателлитной группы (12 месяцев после инъекции).Разрез очень тонкой капсулы вокруг отложения геля со слабо выраженным фиброзом и слабо выраженной инфильтрацией воспалительных клеток. (E) Крыса контрольной группы (12 месяцев после инъекции). CM = кожная мышца; GD = отложение геля; GDC = капсула вокруг отложения геля; GS = пласты геля; F = фиброз; IC = воспалительные клетки; GI = островки геля; G = гель; FT = жировая ткань; CT = соединительная ткань. Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 7. (A) Крыса тестовой группы (15 месяцев после инъекции). Небольшое отложение геля в гиподерм еповерх кожной мышцы с очень тонкой капсулой в пластах отложений геля. (B) Крыса сателлитной группы(15 месяцев после инъекции). Разрез отложений геля. Виден умеренный фиброз и умеренная инфильтрация воспалительных клеток. (C) Крыса сателлитной группы(15 месяцев после инъекции). Виден слабо выраженный фиброз и минимальная инфильтрация воспалительных клеток. GD = отложение геля; CM = кожная мышца; GS = пласты геля; FT = жировая ткань; HF = волосяной фолликул; F = фиброз; IC = воспалительные клетки; GI = островки геля. Окраска гематоксилином и эозином.

Таблица 1

Динамика изменений степени фиброза и инфильтрации воспалительных клеток в тестовой и сателлитной группах после введения препарата Variofill® подкожно.

Период	Группа	Степень фиброза	Степень инфильтрации
6 месяцев	Тестовая Сателлитная	Слабо выраженная От слабо выраженной к умеренной	Минимальная Умеренная
9 месяцев	Тестовая Сателлитная	От слабо выраженной к умеренной От слабо выраженной к умеренной	Слабо выраженная От слабо выраженной к умеренной
12 месяцев	Тестовая Сателлитная	От минимальной к умеренной Слабо выраженная	От минимальной к умеренной Слабо выраженная
15 месяцев	Тестовая Сателлитная	От слабо выраженной к умеренной От минимальной к умеренной	От минимальной к слабо выраженной От слабо выраженной к умеренной
18 месяцев	Тестовая Сателлитная	Слабо выраженная Слабо выраженная	От минимальной к слабо выраженной От минимальной к слабо выраженной

Рис. 8. (A) Крыса тестовой группы (18 месяцев после инъекции). Слияние гелеобразной ГК в метахроматические вакуоли, окруженные фиброзными волокнами. Видны слабо выраженная инфильтрация воспалительных клеток и слабо выраженный фиброз. (B) Крыса сателлитной группы (18 месяцев после инъекции). Видны несколько пустых вакуолей, ранее заполненных гелеобразной ГК, которая к этому моменту была переработана и выведена. Видна умеренная инфильтрация воспалительных клеток. (C) Крыса сателлитной группы(18 месяцев после инъекции). Область умеренной воспалительной реакции со смешенной лейкоцитной инфильтрацией и изменениями нормальной структуры кожи. IC = воспалительные клетки; F = фиброз; GI = островки геляs; G = гель. Окраска гематоксилином и эозином.

По истечении 18 месяцев были видны следы частичной биодеградации гелеобразной ГК, а также несколько пустых вакуолей, ранее заполненных гелеобразной ГК, которая к этому моменту была переработана и выведена (Рис. 8B).После введения высоких доз препарата можно увидеть умеренную воспалительную реакцию по истечении 18 месяцев (Рис. 8B).В данной группе были также замечены смешенная лейкоцитная инфильтрация и изменения нормальной структуры кожи (Рис. 8С).

Контрольная группа. У крыс контрольной группы гистология кожи была нормальной по внешним признакам; отложений геля не было замечено на протяжении всего исследования. Гистология кожи крыс контрольной группы по истечении 12 месяцев показана на Рис. 6Е.

Дата добавления: 2015-05-08