Дослід 1. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові

Практична робота

Теоретичні питання

Тема № 2. Дослідження катаболізму пуринових нуклеотидів. Визначення кінцевих продуктів їх обміну. Спадкові порушення їх обміну.

Мета заняття: Засвоїти особливості реакцій синтезу та розпаду пуринових і піримідинових нуклеотидів в нормі та за умов природжених ензимопатій цих процесів. Оволодіти методами визначення кількості сечової кислоти у біологічних рідинах та вміти інтерпретувати отримані дані.

Актуальність теми: Порушення процесів біосинтезу і катаболізму пуринових та піримідинових азотистих основ та нуклеотидів можуть приводити до розвитку таких захворювань як синдром Леша-Ніхана, подагра, оротацидурія. Знання основних метаболітів та ензимів цих процесів є необхідним для діагностики і контролю за лікуванням.

Конкретні завдання:

Ø Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму пуринових нуклеотидів, порушення синтезу сечової кислоти і біохімічні основи розвитку подагри.

Ø Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму піримідинових нуклеотидів.

Ø Кількісно визначити сечову кислоту в біологічних рідинах, вміти інтерпретувати отримані результати.

1. Біосинтез пуринових нуклеотидів; cхема реакцій синтезу ІМФ; утворення АМФ, ГМФ, АТФ, ГТФ. Регуляція біосинтезу пуринових нуклеотидів за принципом негативного зворотного зв’язку (ретроінгібування).

2. Біосинтез піримідинових нуклеотидів: реакції; регуляція.

3. Біосинтез дезоксирибонуклеотидів. Утворення тимідилових нуклеотидів; інгібітори біосинтезу дТМФ як протипухлинні засоби (структурні аналоги дТМФ, похідні птерину).

4. Катаболізм пуринових нуклеотидів; cпадкові порушення обміну сечової кислоти. Клініко-біохімічна характеристика гіперурикемії, подагри, синдрому Леша-Ніхана.

Принцип методу. Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив з утворенням сполуки блакитного кольору, оптична густина якої за довжини хвилі 640 нм є пропорційною концентрації сечової кислоти у сироватці крові.

Матеріальне забезпечення: сироватка або плазма крові, 10 % розчин натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату, 10 % розчин натрію карбонату, 0,35 М розчин сульфатної кислоти, фосфатвольфраматний реактив (реактив Фоліна), 30 мкМ розчин сечової кислоти, піпетки, пробірки, центрифуга.

Хід роботи: У центрифугову пробірку вміщують 0,5 мл сироватки крові та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірки перемішують і додають 0,25 мл 0,35 М розчину сульфатної кислоти та 0,25 мл 10% розчину натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату. Вміст пробірки перемішують і через 5 хв центрифугують протягом 10 хв за швидкості 3000 об/хв. Проводять визначення сечової кислоти за наступною схемою.

Визначення сечової кислоти в сироватці крові

	Контрольна проба, мл	Стандартна проба, мл	Дослідна проба, мл
Надосадова рідина	-	-
Стандартний розчин сечової кислоти	-		-
Вода дистильована		-	-
Розчин натрію карбонату
Фосфатвольфраматний реактив	0,5	0,5	0,5

Вміст пробірок перемішують. Через 30 хв визначають оптичну густину стандартної та дослідних проб за довжини хвилі 640 нм (590-700 нм, червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі затовшки 10 мм. Забарвлення є стабільним протягом 30 хв.

Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою:

А_о

С = × 30 × 10,

А_с

де: С – вміст сечової кислоти у дослідній пробі, мкмоль/л; А_о – оптична густина дослідної проби; А_с – оптична густина контрольної проби; 30 – вміст сечової кислоти у стандартному розчині, мкмоль/л; 10 – величина розведення сироватки.

У чоловіків вміст сечової кислоти у сироватці крові становить 240-500 мкмоль/л, у жінок – 160-400 мкмоль/л.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.

Дата добавления: 2015-05-24