Бесклеточные системы дают другой плодотворный подход к изучению молекулярных механизмов

8-45

8.10.2. Существует по крайней мере два типа окаймленных пузырьков [68]

Клатрин находится на цитоплазматической поверхности плазматической мембраны и транс-сети Гольджи; по-видимому, этот белок участвует в транспорте, управляемом сигналами. Покрытые клатрином пузырьки отвечают за опосредованный рецепторами эндоцитозный путь от плазматической мембраны к эндосомам, а также за управляемый рецепторами путь от транс-сета Гольджи к эндолизосомам. В первом случае окаймленные пузырьки переносят избранный набор рецепторов клеточной поверхности. Вероятно, это верно и для различных типов покрытых клатрином пузырьков, отпочковывающихся от аппарата Гольджи.

Окаймленные клатрином пузырьки не отделяются ни от ЭР, ни от цис- или промежуточных цистерн аппарата Гольджи. Вместо них гам (а также и в транс-сети Гольджи) существует другой тип окаймленных пузырьков. Они не окрашиваются антителами к клатрину и отличаются от клатриновых окаймленных пузырьков при анализе в электронном микроскопе (рис. 8-83). Белки «каймы» этих пузырьков еще не идентифицированы.

Возможная модель белкового транспорта в неполяризованных клетках представлена на рис. 8-84. В соответствии с этой моделью, белки «по умолчанию» перемещаются из ЭР в аппарат Гольджи, от одной цистерны Гольджи к другой и от транс-сети Гольджи к поверхности клетки.

Предполагают, что этот неизбирательный процесс происходит при помощи неклатриновых окаймленных пузырьков. От транс-сети Гольджи управляемый рецепторами транспорт в лизосомы происходит с участием клатриновых окаймленных пузырьков, а транспорт к секреторным гранулам - с участием частично покрытых клатрином пузырьков. Каким образом можно проверить эту модель?

Рис. 8-83. Сравнение клатриновых и неклатриновых окаймленных пузырьков. А, Электронная микрофотография цистерн Гольджи из бесклеточной системы, в которой происходит отпочковывание неклатриновых окаймленных пузырьков в пробирке. Клатриновые окаймленные пузырьки, показанные на фото (Б), имеют гораздо более упорядоченное строение. (Электронные микрофотографии любезно предоставлены Lelio Orci, см. L. Ог-ci, В. Click, and J. Rolhman, Cell, 46: 171-184.)

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

Рис. 8-84. Гипотетическая модель транспорта белков в неполяризованных клетках. Полагают, что неизбирательный (конститутивный)

транспорт происходит при помощи неклатриновых окаймленных пузырьков, а различные варианты регулируемого сигналами транспорта при помощи клатриновых окаймленных пузырьков. Эти пузырьки отпочковываются от транс- сети Гольджи, эндосом и плазматической мембраны. В поляризованных клетках необходим еще дополнительный регулируемый сигналами транспортного от транс-сети Гольджи.

8.10.3. Раскрыть механизм транспорта помогают мутантные клетки с нарушенной секрецией [69]

Так как транспорт исключительно важен для эукариотической клетки, то мутантные клетки, неспособные осуществлять один из его этапов (например, дефектные по маркеру стыковки или акцепторному белку), должны были бы гибнуть. Однако, если мутантный белок не функционирует только при высоких температурах, в обычных условиях клетка с таким дефектом вполне жизнеспособна. У дрожжей было выявлено более 25 температурочувствительных (термочувствительных) мутаций в генах, отвечающих за секрецию. Клетки, несущие такие мутации, не способны при высоких температурах транспортировать белки из ЭР в аппарат Гольджи, от одной цистерны Гольджи к другой, из аппарата Гольджи к вакуоли или к плазматической мембране.

Используя температурочувствительные мутанты дрожжей, легко клонировать гены этого организма, ответственные за транспорт. Такой подход чрезвычайно плодотворен, т. к. позволяет напрямую выявить главные белки транспортного механизма, не зная даже, как происходит секреция. Один из дрожжевых генов, отвечающих за секрецию, который был выявлен таким образом - это ген sec 4. Полагают, что он кодирует GTP-связывающий белок из семейства ras (см. разд. 12.3.11 и 13.4.6). Биохимические эксперименты на клетках млекопитающих свидетельствуют о том, что сходный GTP-связывающий белок участвует в везикулярном транспорте и у высших эукариот. Возможно, он регулирует «раздевание»

неклатриновых окаймленных пузырьков перед их связыванием с мембранами.

везикулярного транспорта [70]

Чтобы понять молекулярные механизмы, лежащие в основе потока веществ между мембранными компартментами, надо выявить основные «рабочие части» транспортных пузырьков. Каким образом транспортные пузырьки отпочковываются от мембраны? Что направляет их к мембранам-мишеням? Как они сливаются с мембранами? Кроме только что описанных генетических экспериментов для ответа на эти вопросы были использованы опыты по реконструкции везикулярного транспорта в бесклеточной системе. Впервые этого удалось добиться для стопки Гольджи. Когда выделенные стопки Гольджи инкубировали

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

Рис. 8-85. Бесклеточная система, воссоздающая везикулярный транспорт вирусного белка между цистернами аппарата Гольджи. Когда препарат стопок Гольджи инкубируют с цитозольными экстрактами и АТР, от цистерн отпочковываются неклатриновые окаймленные пузырьки.

Вирус везикулярного стоматита (VSV) кодирует белок оболочки, называемый G-белком. Чтобы понятъ., как происходит транспорт отого трансмембранного белка между цистернами аппарата Гольджи, две популяции выделенных стопок Гольджи инкубировали вместе. Популяция-

«донор» была получена из инфицированных VSV мутантных клеток, не имеющих GlcNAc-трансферазы I. (поэтому в «донорной» популяции стопок Гольджи не происходит включения остатков GlcNAc в N-связанные олигосахариды G-белка). «Акцепторные» стопки Гольджи были получены из неинфицированных клеток дикого типа и поэтому содержали нормальную копию GlcNAc-трансферазы, но не содержали G-белка. Следовательно, для присоединения к G-белку GlcNAc нужно, чтобы этот белок из цис -компартмента донорной стопки Гольджи попал в промежуточный

компартмент стопки-акцептора. Проверить, идет ли сопряженное с транспортом гликозилирование, можно, наблюдая за включением в G-белок [3H]-GlcNAc из UDP-[3H]-GlcNAc, добавленного в культуральную среду. Как показано на графике справа, транспорт идет только тогда, когда добавляется и цитозольный экстракт, и АТР. Такие же условия необходимы для отпочковывания неклатриновых окаймленных пузырьков. Такая схема опыта, впервые примененная для того, чтобы понять механизм переноса из цис -компартмента Гольджи в его промежуточный компартмент, позволила также воссоздать in vitro транспорт из ЭР в цис -аппарат Гольджи, из промежуточного в транс- компартмент Гольджи, от транс -

аппарата Гольджи к плазматической мембране, от эндосом к лизосомам, и от транс -аппарата Гольджи к эндолизосомам.

с цитозолем и АТР, от их краев отшнуровывались неклатриновые окаймленные пузырьки, которые, по-видимому, переносили белки между цистернами (рис. 8-83, А). Прослеживая последовательный процессинг олигосахаридов на гликопротеинах по мере их продвижения из одного компартмента Гольджи к другому, стало возможным реконструировать in vitro процесс везикулярного транспорта (рис. 8-85).

Было обнаружено, что отпочковывание неклатриновых окаймленных пузырьков в такой бесклеточной системе требует наличия смеси белков из цитозоля и АТР, из чего следует, что это активный процесс, а не простая самосборка. Необходимые для транспорта компоненты эволю-

ционно крайне консервативны, так как в экспериментах по реконструкции цитозоль животной клетки можно с успехом заменить цитозолем дрожжей или растений. Таким образом, для идентификации молекул,

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

участвующих в везикулярном транспорте, можно сочетать генетический подход, используемый для клеток дрожжей, и бесклеточные системы млекопитающих.

Заключение

ЭР и каждый компартмент аппарата Гольджи содержат уникальные наборы белков. По-видимому, эти белки задерживаются в

органеллах благодаря имеющимся у них специальным сигналам. При этом большая часть веществ переносится от ЭР к аппарату Гольджи, сквозь

стопку Гольджи и от транс-сети Гольджи к поверхности клетки автоматически. Высказано предположение, что транспорт при таком

неизбирательном пути происходит с участием неклатриновых окаймленных пузырьков, которые не специализируются в зависимости от

содержимого. В то мое время транспорт, управляемый сигналами (сортировка), опосредован покрытыми клатрином окаймленными пузырьками.

Чтобы проверить эти гипотезы, необходимо расшифровать молекулярные механизмы, участвующие в отпочковывании транспортных пузырьков, направлении их к мишеням и слиянии с мембранами. В генетических экспериментах на дрожжах идентифицировано более 25 генов, продукты

которых отвечают за отдельные стадии транспорта. Кроме того, для млекопитающих разработаны бесклеточные системы, в которых

происходило избирательное отпочковывание и слияние пузырьков. Вероятно, именно сочетание генетического и биохимического подходов

позволит в будущем выделить в чистом виде многие белки, участвующие в этих процессах.

Литература

Дата добавления: 2015-08-31