Практичне заняття З 3 страница

— розітріть і змішайте бактеріологічною петлею досліджу­вану культуру з краплею ізотонічного розчину натрію хлориду (КА);

— змішайте досліджувану культуру з краплею сироватки (Д);

— оцініть результати через 1—3 хв;

Увага! Оцінювання результату починають з оцінювання контролів: КА — рівномірне помутніння, КС — крапля про­зора. У разі появи пластівців у колі Д на фоні прозорої рідини реакція позитивна (антиген відповідає антитілу), а в разі рів­номірного помутніння — реакція негативна (антиген не відпо­відає антитілу). Іноді результат оцінюють за допомогою лупи або мікроскопа (реакція мікроаглютинації).

— помістіть предметне скло в дезінфекційний розчин.

3. Проведення розгорнутої реакції аглютинації. Облік та оцінювання її результатів

Завдання 3. Ознайомтеся з технікою проведення та об­ліком результатів розгорнутої реакції аглютинації.

Розгорнуту реакцію аглютинації здебільшого використову­ють для серологічної діагностики інфекційних хвороб: для діа­гностики черевного тифу — реакцію Відаля, для діагностики бруцельозу — реакцію Райта й інші, визначення титру імунної аглютинуючої сироватки, а також для серологічної ідентифіка­ції культури бактерій (Е. coli, бруцел).

Для проведення розгорнутої реакції аглютинації з метою серологічної діагностики використовують такі інгредієнти: си­роватку крові хворого (невідоме антитіло), діагностикум (відо­мий антиген) та ізотонічний розчин натрію хлориду.

Для серологічного дослідження у хворого беруть кров на 5—7-й день від початку захворювання, коли в ній накопичить­ся достатня кількість антитіл; у реконвалесцента — з метою ретроспективного діагнозу; у здорової людини — з метою вияв­лення латентної інфекції або бактеріоносійства.

Кров слід брати натще або не раніше ніж через 6 год після споживання їжі, оскільки в ній можуть накопичуватися краплі жиру, що робить сироватку каламутною (хільозна сироватка) та непридатною для дослідження. Найчастіше кров забирають із ліктьової вени або з пучки IV пальця, можна брати із мочки вуха, у дітей грудного віку — із п'ятки.

Забір крові потрібно проводити в асептичних умовах та з до­триманням правил техніки безпеки.

На суху чисту стерильну пробірку наклеюють етикетку, в якій зазначають: номер і назву матеріалу, заклад (відділення), або місце, де був взятий матеріал, прізвище, ім'я та по батькові хворого, дату і час взяття матеріалу. Окремо заповнюють бланк направлення встановленого зразка, в якому зазначають: номер і назву матеріалу, заклад (відділення) або місце, де був взятий матеріал, кратність направлення матеріалу (первинно чи по­вторно), прізвище, ім'я та по батькові хворого, його вік, дату захворювання, попередній діагноз, мету дослідження, дату і час взяття матеріалу, прізвище та посаду особи, яка направляє матеріал на мікробіологічне дослідження.

Потім одягають маску і гумові рукавички, ретельно обро­бляють ділянку шкіри на ліктьовому згині послідовно двома ватними тампонами, змоченими 70 % етиловим спиртом. Кров беруть стерильним шприцом в об'ємі 3—5 см³. Для запобігання гемолізу голку знімають зі шприца, а кров обережно вилива­ють через канюлю у стерильну пробірку так, щоб вона стікала по стінці пробірки. Пробірку закривають гумовою пробкою. Краще збирати кров у спеціальну пробірку типу "Епендорф". Потім кров доставляють до лабораторії не пізніше 2—3 год у спеціальних контейнерах або біксах, на дно яких кладуть сер­ветку з адсорбівного матеріалу. Направлення на дослідження упаковують окремо.

Забороняється обертати направлення навколо посудини з об'єктом дослідження та вкладати його в контейнер або бікс!

Для отримання сироватки кров вміщують у термостат за температури 37 °С на ЗО хв (довше залишати не можна, оскіль­ки відбудеться гемоліз). Утворений згусток відокремлюють від стінок пробірки стерильною запаяною пастерівською піпеткою або скляною паличкою і ставлять у холодильник за температу­ри 4—10 °С на 1—2 год, а для кращого відстоювання — на 18— 20 год. Можна відділяти сироватку центрифугуванням.

Сироватку можна зберігати над згустком не довше ніж 48 год (пізніше настає гемоліз). Якщо сироватка буде викорис­тана пізніше ніж через 48 год, її відсмоктують стерильною пі­петкою з гумовою грушею і переносять у стерильну пробірку. Чиста стерильна сироватка зберігається у холодильнику до 1 міс. Головна вимога до сироватки — її прозорість.

Для постановки розгорнутої реакції аглютинації з метою се­рологічної діагностики використовують здебільшого стандарт­ні антигени, які виробляють у науково-дослідних закладах. Вони містять інактивовані мікроорганізми або їх антигени. Ці антигени називають діагностикумами (від грец. diagnostikos — здатний розпізнавати). Діаностикуми для реакції аглютинації випускають у рідкому або ліофілізованому стані в ампулах або флаконах.

Перед використанням діагностикум перевіряють на придат­ність. Звертають увагу на цілість посудини, чіткість надпису на ампулі чи флаконі, відповідність його надпису, зазначеному в інструкції та на коробці, відповідність зовнішнього вигляду до зазначеного в інструкції, термін придатності.

Перед використанням рідкий діагностикум збовтують, ліо-філізований — розчиняють. Він повинен бути рівномірно кала­мутним, не утворювати пластівців.

Розгорнуту реакцію аглютинації з метою серологічної діа­гностики проводять здебільшого для виявлення антитіл у си­роватці крові хворого. Оскільки використовують нативну си­роватку, перед постановкою реакції її розводять. Розведення сироватки називається титруванням.

Алгоритм "Проведення розгорнутої реакції аглютинації": — підберіть 7 аглютинаційних пробірок однакового розмі­ру, кольору скла, однакової конфігурації дна і 1 пробірку для робочого розведення;

— візьміть стерильні градуйовані піпетки об'ємом 5 см³ і 1 см³; 1 пастерівську піпетку;

— поставте у штатив 3 стерильні пробірки і позначте, для яких піпеток вони призначені;

— розгорніть стерильні піпетки і поставте у відповідні про­бірки;

Увага! Піпетки мають зберігатися до кінця досліду!

— підпишіть пробірки: І — номер, вид антигену, 1:50; II — 1:100; III — 1:200; IV — 1:400; V — 1:800; VI — КС (контроль сироватки); VII — КА (контроль антигену); окрему пробірку позначте літерами Рр (робоче розведен­ня);

— внесіть у пробірку, позначену Рр, піпеткою об'ємом 5 см³ 4,9 см³ ізотонічного розчину натрію хлориду, у дослідні (крім першої і КС) — по 1 см³;

— внесіть піпеткою об'ємом 1 см³ 0,1 см³ досліджуваної си­роватки в пробірку, позначену Рр, перемішайте (розве­дення 1:50);

— внесіть по 1 см³ розведеної (1:50) сироватки у пробірки першу, другу і КС;

— перемішайте та перенесіть 1 см³ сироватки з другої про­бірки у третю, 1 см³ із третьої у четверту, 1 см³ із четвер­тої у п'яту, 1 см³ із п'ятої у дезінфекційний розчин;

— додайте пастерівською піпеткою у кожну пробірку (крім КС) по 2 краплі діагностикуму;

Увага! Діагностикум додається у кожну пробірку обов'язково в однаковій кількості!

— струсіть пробірки та поставте їх у термостат (37 °С);

— вийміть пробірки з термостата через 2 год;

— проведіть попередній облік результатів, поставте пробір­ки в штатив і залиште їх за кімнатної температури;

— проведіть остаточний облік результату реакції через 18— 20 год.

Облік результату розгорнутої реакції аглютинації почина­ють з контролю: КС — рідина прозора, КА — рівномірне помут­ніння або осад у вигляді ґудзика, а під час збовтування утворю­ється рівномірне помутніння (реакція негативна).

Потім оглядають дослідні пробірки, порівнюючи пробір­ки першу і другу, другу і третю, третю і четверту, четверту і п'яту.

Увага! У разі позитивної реакції утворюється осад, що по­криває все дно пробірки у вигляді перевернутої парасольки, під час збовтування видно пластівці.

Реакція різко позитивна (++++) — осад у вигляді перевер­нутої парасольки на все дно, рідина прозора.

Реакція позитивна (+++) — розмір осаду менший, відсутнє повне просвітління рідини.

Реакція слабопозитивна (++) — розмір осаду ще менший, рідина каламутна.

Сумнівний результат реакції (+) — незначний осад, рідина каламутна.

Реакція негативна — осаду немає або осад у вигляді ґудзи­ка, рідина рівномірно каламутна.

Позитивним вважають результат з оцінкою осаду (++++) або (+++).

Останнє розведення, в якому реакція аглютинації має по­зитивне значення, називається титром сироватки, його зазна­чають у відповіді.

Здебільшого діагностичним вважають титр сироватки 1:100. Але ніколи не обмежуються одноразовим проведенням реакції аглютинації. Зазвичай її повторюють через 1—2 тиж. За наяв­ності захворювання кількість антитіл (титр сироватки) у крові зростає, тому під час повторного проведення реакції аглюти­нації спостерігається наростання титру антитіл у сироватці у 2—4 рази. Це дає змогу відрізнити хворого від тієї людини, яка перехворіла або якій було зроблено щеплення. В останніх двох випадках зростання титру антитіл у сироватці крові не спосте­рігається.

Контрольні запитання

1. На чому ґрунтується серологічний метод діагностики?

2. Які серологічні реакції найбільш широко використову­ються в лабораторній практиці?

3. На яких властивостях серологічних реакцій ґрунтуєть­ся їх застосування?

4. Які проблеми вирішують за допомогою серологічних ре­акцій?

5. Який посуд використовують для проведення серологіч­них реакцій? Яким вимогам він має відповідати?

6. Які інструменти і яку апаратуру використовують для проведення серологічних реакцій?

7. Які сироватки називають імунними діагностичними? Як їх виготовляють?

8. Чим відрізняються нативні імунні діагностичні сироват­ки від адсорбованих? Яка різниця у їх використанні?

9. Що таке титр сироватки?

10. Які антитіла називають специфічними, які — неспеци­фічними?

11. Які адсорбовані сироватки називають монорецепторни-ми, які — полівалентними?

12. Що таке аглютинація? За якою ознакою її виявляють?

13. З якою метою проводять реакцію аглютинації на склі?

14. У чому полягає принцип проведення реакції аглютина­ції на склі?

15. Як враховують результати реакції аглютинації на склі?

16. З якою метою використовують розгорнуту реакцію аглютинації?

17. Які інгредієнти використовують у разі проведення роз­горнутої реакції аглютинації?

18. Яких умов слід дотримуватися у разі забору крові на се­рологічне дослідження?

19. Як оформляють і доставляють у лабораторію взяту на дослідження кров?

20. Як отримують і за яких умов зберігають сироватку крові?

21. Який антиген використовують для серологічної діагнос­тики захворювання? У якій формі його випускають? Як перевіряють його на придатність?

22. Який посуд використовується у разі проведення розгор­нутої реакції аглютинації?

23. За якими ознаками слід підбирати пробірки?

24. Як маркірують посуд для проведення реакції аглютина­ції?

25. Як проводять титрування сироватки?

26. За яких умов і впродовж якого часу відбувається розгор­нута реакція аглютинації?

27. Як враховують результат реакції аглютинації?

28. Як визначають титр сироватки, як його зазначають у відповіді?

29. Як за допомогою реакції аглютинації відрізнити хворо­го від того, що перехворів або був щеплений?

Тести

1. Під час серологічної діагностики у сироватці крові виявля-
ють:

а) невідоме антитіло;

б) невідомий антиген;

в) усі відповіді правильні.

2. Серологічна ідентифікація культури мікроорганізмів поля-
гає у визначенні:

а) антигенної структури;

б) форми клітини;

в) здатності розчинятися специфічним фагом;

г) спорідненості до барвників.

3. Імунні діагностичні адсорбовані сироватки містять:

а) відомий антиген;

б) специфічні антитіла;

в) неспецифічні та специфічні антитіла;

г) всі відповіді правильні.

4. Кров на серологічне дослідження відбирають:

а) у 1-й день захворювання;

б) на 2-й день захворювання;

в) наприкінці 1-го тижня захворювання;

г) всі відповіді правильні.

5. Як діагностикум у серологічних реакціях можуть бути ви-
користані:

а) завис живих мікроорганізмів;

б) завис убитих мікроорганізмів;

в) окремі антигени мікроорганізмів;

г) всі відповіді правильні.

Ситуаційні задачі

1. Оцініть результати реакції аглютинації на склі із прозо-
рою краплею у КС:

1) у КА — рівномірне помутніння, у Д — пластівці;

2) у КА ІД — рівномірне помутніння;

3) у К А ІД — пластівці.

2. Під час проведення розгорнутої реакції аглютинації з си-
роваткою крові, відібраної на 6-й день хвороби, титр сироват-
ки з черевнотифозним діагностикумом виявився 1:50. Під час
повторного проведення реакції через 2 тиж після першого титр
сироватки становив 1:200. Як оцінити цей результат?

З Під час проведення розгорнутої реакції аглютинації з си­роваткою крові, відібраної на 6-й день хвороби, титр сироват­ки з черевнотифозним діагностикумом виявився 1:50, під час повторного проведення реакції через 2 тиж після першого титр сироватки становив 1:50. Як оцінити цей результат?

4. Під час проведення розгорнутої реакції аглютинації си­роватку крові хворого розвели у співвідношенні від 1:50 до 1:1600. У першій і другій дослідних пробірках осад оцінюється (++++), у третій — (+++), у четвертій — (++), у п'ятій — (+), у шостій — (-). Який титр цієї сироватки?

Домашнє завдання

Підготуйтеся до практичного заняття 6.

Рекомендації щодо самопідготовки до практичного заняття 6

1. Ознайомтеся з темою і метою практичного заняття, запи­шіть у щоденнику тему і план заняття.

2. Вивчіть теоретичний матеріал (див. підручник, с. 165— 189; практикум, с. 79—89).

Дата добавления: 2014-11-20