Экспериментальная часть. Дополнительная литература

Дополнительная литература

13.2.1. Березин И. В., Савин Ю. В. Основы биохимии. – М.: Изд-во МГУ, 1990. – С. 130 – 165.

13.2.2. Методы химии углеводов. Под ред. Н. К. Кочеткова. – М.: Мир, 1967. – 512 с.

13.2.3. Методы исследования углеводов. Под ред. А. Я. Хорлина. – М.: Мир, 1975. – 444 с.

13.2.4. Чирков Ю. Г. Фотосинтез: два века спустя. – М.: Знание, 1981. – 192 с.

13.2.5. Павлов А. В. Эмбриональное развитие и гистофизиология органов у детей и подростков – http://www.yma.ac.ru/books/hist/child.htm

13.2.6. Бегун П. И., Шукейло Ю.А. Биомеханика. Учебник для ВУЗов. – СПб.: Изд-во Политехника, 2000. – 463 с.

13.2.7. Фаллер Д. М., Д. Шилдс. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. – М.: Бином-Пресс, 2004. – 272 с.

Очевидно, что выявлениеи количественное определение глицидов может быть важным в экологических и отраслевых изысканиях, связанных с лесоводством, сельским хозяйством и пищевой промышленностью, а самая популярная даже в быту – качественная реакция на запасные гликаныс йодом. К сожалению, механизм ее развития до конца не понят, но с большой долей вероятности его объясняют сорбцией атомов иода между остатками моноз. Из качественных реакций на монозы и дисахара, вспомним про образование окрашенных продуктов конденсации – фурфурола и озазонов, а также реакции серебряного и медного «зеркала», Троммера, с фелинговой жидкостью, реактивом Бенедикта и т.п. Т.к. они рассмотрены в курсе органической химии и, частью, в занятии 11.3.3, добавим лишь, что фильтровальная бумага, пропитанная подобными реактивами, служит основой редуктометрических тест-полосок для экспресс-анализа глюкозы в биожидкостях.

Для нужд физиологии, ветеринарии и медицины исключительно важно количественное определение глюкозы, как основной монозы плазмы животных и интегрального показателя углеводного гомеостаза. В норме, независимо от пола, её концентрация у взрослых людей составляет 4,16 – 5,27 ммоль/л. Но, в зависимости от метода исследований, на результат могут влиять: 1) способ удаления из крови, мешающих определению белков и клеток и 2) степень специфичности и чувствительности качественной реакции, примененной в фотометрии. Поэтому в лабораторной практике, с учетом способа определения, нормальными считаются вариации уровня глюкозы от 2,50 до 6,38 ммоль/л. Так, ряд лабораторий до сих пор применяет в этих целях относительно простой и надежный ортотолуидиновый способ, сохраняющий обычные недостатки колориметрических методик. Но альтернативой ему, все чаще служат высокоспецифичные энзиматические методы, с разной степенью их автоматизации и экспрессности.

13.3.1. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в био-жидкостях с помощью тест-наборов фирмы Lachema (Чехия)

Он возможен без осаждения белков плазмы, но при определении глюкозы в цельной крови, плазме и сыворотке с признаками гемолиза, липемии и желтухе = иктерии, субстраты предварительно депротеинизируют. Поэтому целесообразно привести более полный вариант анализа.

Принцип метода: Белки проб осаждают депротеинизирующим раствором, содержащим уранилацетат, токсичный, как все соли тя-желых металлов! ВНИМАНИЕ!!! При попадании раствора внутрь, немедленно выпить 0,5 л воды и вызвать рвоту, а затем действовать по пункту 1.1.31. В соответствии со схемой (рис. 13.3), ФАД-зависимый Е микробного происхождения глюкозооксидаза в роли биосенсора, специфично окисляет глюкозу в безбелковом надосадке, а затем регенерирует ФАДН₂ с помощью кислорода атмосферы. Т.к. сходство структуры и свойств глюкозы и глюконовой кислоты затрудняют их различение, обычно определяют эквимолярную концентрацию пероксида водорода. В данном методе это делают с помощью сопряженной пероксидазной реакции азосочетания, после чего, против воды и стандарта = эталонного раствора глюкозы, фотометрируют интенсивность окраски продукта.

Рис. 13.3. Схема ферментного анализа количества глюкозы

Ход работы: 1. В маркированную центрифужную пробирку внести 0,5 мл раствора 2 (смесь 0,02 М уранилацетата в 0,82 М хлориде натрия).

2. В соответствии с п. 3.3.1, с помощью полуавтоматического дозатора добавить в пробирку 50 мкл цельной крови с антикоагулянтом, перемешать и оставить в штативе на 10 мин.

3. Согласно п. 6.3.1., попарно уравновесить пробирки на центрифужных весах и разместить их в гнездах по диаметру ротора центрифуги.

4. Убедившись, что все студенты выполнили пп. 1-3, дежурный закрывает центрифугу крышкой и, соблюдая п. 1.1.20, включает ее при 1500 об/мин на 15 мин.

5. Во время центрифугирования, в 2 пробирки внести по 0,5 мл раствора уранилацетата и, меняя наконечники, добавить дозатором в контроль – 50 мкл дистиллята, а в эталон – 50 мкл раствора 1 (стандарт глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л).

6. После центрифугирования, из пробирок, меняя наконечник дозатора, соответственно таблице в 3 маркированных пробирки вносят:

7. Пробы перемешать и поместить в термостат при 37 С на 30 мин.

8. За 10 мин до окончания инкубации, в соответствии с работой 4.3.1, включить для прогрева ФЭК КФК-2,

9. Фотометрировать пробы 2 и 3 против контроля, при λ = 480 нм в кюветах толщиной 5 мм. Результаты измерений абсорбции = А занести в протокол опыта.

10. В соответствии с формулой: Глюкоза, ммоль/л = 10 х А2/А3, где: А2 – абсорбция пробы и А3 – эталона, рассчитать ее концентрацию в крови и сделать выводы из работы.

12.3.2. Определение глюкозы в крови с помощью экспресс-анализатора Эксан-Г (Литва)

Принцип метода: Е-биосенсор – та же глюкозооксидаза, что и в предыдущей работе. Но, ее не вносят в раствор, а заранее иммобилизуют в геле на пленке = мембране, снабженной резиновым кольцом. Перед началом эксплуатации прибора, мембрану с помощью кольца фиксируют на торце датчика - кислородного электрода Кларка, вмонтированного в проточную измерительную ячейку. Количество продукта реакции – Н₂О₂, эквимолярно не только концентрации глюкозы, но и расходу кислорода в пространстве между мембраной и электродом. Поэтому, возникший на нем электрохимический потенциал, с помощью уравнения Нернста «вшитого» в микросхему, преобразуется в ммоль/л глюкозы и выводится на табло прибора. После ручной или автоматической регистрации показаний, для подготовки прибора к новому циклу работы, измерительную ячейку промывают буферным раствором.

Примечания: 1. В процессе хранения и эксплуатации устройства, иммобилизованный Е неизбежно денатурирует. Поэтому запасные мембраны хранят в холодильнике, с гарантированным временем работы 80 ч, а в конструкции прибора предусмотрены 3 уровня чувствительности.

2. В соответствии с «Инструкцией по эксплуатации анализатора глюкозы «Эксан Г», заливку буферного раствора и заправку мембраны в датчик, до начала занятий проводит лаборант.

3. Также, лаборант включает прибор в электросеть и, после каждого включения, калибрует его с помощью 50 или 20 мкл доз эталонного раствора глюкозы.

Ход работы: 1. Кнопкой «Промывка» на лицевой панели при-бора включить перистальтический насос и, промыть измерительную ячейку буферным раствором. Окончание промывки через 90 с, ограничивает автоматика устройства.

2. Нажать на лицевой панели прибора кнопку «Сброс» и убедиться, что на табловысветились цифры «0.00». Отклонение от «правого нуля» на 2-3 единицы допустимо. Если же высветилось другое –нажать кнопку «Сброс» и повторить п. 1. При высвечивании других цифр и неустойчивости показаний – обратиться к лаборанту или преподавателю.

3. Под контролем лаборанта, из пробирки с образцом цельной крови с антикоагулянтом, набрать в наконечник полуавтоматического дозатора 50 или 20 мкл

4. Ввести наконечник дозатора в коническое отверстие проточной кюветы и, плавно нажав кнопку дозатора до второго упора, внести дозу крови в измерительную ячейку.

5. Не отпуская кнопки, вывести наконечник дозатора из проточной кюветы, отпустить кнопку, сбросить в маркированную тару использованный наконечник и поставить дозатор в штатив.

6. Через 5-10 секунд после введения пробы, появившиеся на табло показания прибора занести в протокол работы.

7. Повторить пп. 1 и 2 данной инструкции и, за время подготовки прибора к новому циклу работы, убрать рабочее место.

8. По окончании работы всех студентов с анализатором, поставить в известность об этом лаборанта.

9. Завершить оформление протокола выводами.

12.3.3. Определение глюкозы в крови с помощью автономного экспресс-измерителя ПКГ-02-«Сателлит» (Россия)

Принцип метода: Миниатюрный глюкометр работает от внутреннего источника = батарейки напряжением 3 В, управляется с помощью одной кнопки, но зависит от одноразовых электрохимических полосок ПКГЭ-02, изготовленных на основе «сухой химии». Это позволяет применять его в полевых условиях, при чрезвычайных ситуациях, скрининге и оперативном контроле индивидуального пользования. Но, показания прибора должно рассматривать лишь как ориентировочные, требующие подтверждения лабораторным методом и не дают оснований изменять дозировку лекарств без ведома врача. Поэтому можно лишь предполагать, что биосенсор полосок – все та же глюкозооксидаза, иммобилизованная в геле, степень сшитости которого исключает влияние белков и форменных элементов крови. Судя по скорости анализа, химический сигнал преобразуется в электрическую форму, тоже по принципу кислородного электрода Кларка.

Технические характеристики:

1. Диапазон показаний прибора от 1,8 до 35 ммоль/л глюкозы.

2. Объем памяти – 40 последних показаний.

3. Режим хранения и пользования прибором ПКГ-02-«Сателлит», в комплекте с одноразовыми полосками ПКГЭ-02, изложен подробно в прилагаемых к устройству Инструкции и Руководству по эксплуатации.

Противопоказания к применению:

1. Анализ сыворотки, венозной, разведенной, сгущенной или хранившейся крови.

2. Анализ после приема внутрь > 1 г аскорбиновой кислоты и у больных с инфекциями, массивными отеками и злокачественными опухолями.

3. Полоски с просроченным сроком годности или несовпадением их пятизначного кода с кодом, хранящимся в памяти прибора.

Ход работы: 1. Достать из футляра прибор и полоски, разместив их на ровной поверхности.

2. Убедиться, что срок годности полосок не истек.

3. Надорвать края индивидуальной упаковки полоски, снять ее меньшую часть, закрывающую контакты, проводниками вверх, вставить полоску в гнездо прибора и, удалить остальную часть упаковки.

5. Нажать и отпустить кнопку прибора.

6. В случае несовпадения кодов полоски и высветившегося на табло – действовать соответственно инструкции к устройству.

7. При совпадениении кодов – повторно нажать и отпустить кнопку прибора. Появление на табло цифр «88.8» – признак готовности устройства к работе.

8. Обработать подушечку 4-го пальца кисти спиртосодержащим тампоном и, подсушив ее, проколоть кожу одноразовым стерильным скарификатором.

9. Выдавив каплю крови на пальце, аккуратно коснуться ею рабочей зоны полоски, добившись ее полного смачивания.

10. Звуковой сигнал прибора и мелькающие на табло цифры обратного счета свидетельствуют, что образец включен в анализ.

11. Через 40 секунд на табло высветится измеренная концентрация глюкозы, которую заносят в протокол опыта.

12. В третий раз нажать и отпустить кнопку прибора. Погасшее табло свидетельствует, что прибор выключен, а результат анализа включен в его память.

13. Извлечь использованную полоску и, убрать за собой рабочее место.

Дата добавления: 2014-12-27