Сайт-специфические ДНК-связывающие белки можно выделить и охарактеризовать, используя их сродство к

ДНК [7]

Впервые сайт-специфические белки, связывающиеся с ДНК, были обнаружены у бактерий. С помощью генетического анализа у этих микроорганизмов удалось доказать существование регуляторных белков, таких как репрессор lac-оперона, репрессор бактериофага лямбда и сго-

белок. Эти белки были выделены при последовательном фракционировании клеточных экстрактов на хроматографических колонках, а специфически связывающие их участки ДНК определены методом футприн-тинга (см. разд. 4.6.6). Аналогичными методами были выделены и охарактеризованы первые сайт-специфические ДНК-связывающие белки у эукариот: Т-антиген вируса SV40, фактор транскрипции TF11IA и рецептор стероидного гормона.

В настоящее время для выделения сайт-специфических ДНК-связывающих белков разработаны гораздо более совершенные методы.

Процедура обычно начинается с определения сдвига подвижности в геле. Благодаря этому можно выяснить, с каким именно участком на фрагменте ДНК связывается неизвестный белок в клеточном экстракте (см. рис. 9-9). Затем химическим способом синтезируется соответствующий этому связывающему участку двухцепочечный олигонуклеотид, который можно использовать двумя способами. При аффинной хроматографии

олигонуклеотид связывают с нерастворимым пористым носителем, например агарозой, а затем таким нагруженным носителем заполняют колонку, которая селективно связывает белки, узнающие определенные последовательности ДНК. Этот относительно нетрудоемкий метод позволяет добиться 10000-кратной очистки.

Большинство белков, связывающихся с определенной последовательностью ДНК, присутствуют в клетках высших эукариот в количестве нескольких тысяч копий на клетку (что соответствует примерно одной молекуле из 50000 молекул всех белков клетки). Этого количества оказывается достаточно, чтобы методом аффинной хроматографии выделить белок той степени чистоты, которая позволяет определять у него аминоконцевую последовательность аминокислот. Это дает возможность синтезировать олигонуклеотидный зонд и с его помощью идентифицировать соответствующий клон кДНК. Имея в руках нужный клон кДНК, исследователь может определить полную аминокислотную последовательность белка и получать его в неограниченных количествах. В некоторых случаях клон кДНК, кодирующий сайт-специфический ДНК-

связывающий белок, легче получить более простым путем, используя второй метод, еще более эффективный, чем аффинная хроматография ДНК.

Этот метод начинается с получения библиотеки кДНК в соответствующим образом подобранном векторе. Отдельная колония бактерий (если экспрессирующий вектор - плазмида) или негативная колония (если вектор-бактериофаг) будет продуцировать большое количество белка, закодированного в содержащейся в ней кДНК. Чтобы найти ту редкую колонию, которая образует нужный белок, олигонуклеотид, содержащий соответствующий сайт связывания, метят радиоактивной меткой и используют его в качестве зонда на бумаге, куда нанесены аликвоты отдельных колоний (см. разд. 5.6.5). Те немногие колонии, которые синтезируют белки, специфически связывающие меченый олигонуклеотид, выращивают отдельно и испытывают дальше, чтобы найти среди них ту единственную, продуцирующую искомый белок.

Этот высоко эффективный метод разработан сравнительно недавно и поэтому на сегодняшний день из многих сотен сайт-специфических ДНК-связывающих белков, которые, как полагают, присутствуют в клетках высших эукариот, удалось выделить лишь небольшую часть.

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

9.1.9. Многие сайт-специфические ДНК-связывающие белки имеют одинаковые области [8]

Фактор транскрипции III A (TFIIIA) эукариот необходим для инициации синтеза небольших рибосомных РНК (5S-pPHK); он связывается в виде мономера с последовательностью ДНК размером около 50 нуклеотид-ных пар, расположенной почти в середине очень маленького гена 5S-pPHK. Аминокислотная последовательность этого белка дает основание предполагать, что он организован в виде серии девяти повторяющихся доменов, каждый из которых содержит по 30 аминокислот, сложенных в одну структурную единицу вокруг атома Zn, связывающего два остатка цистеина и два-гистидина. Другие белки, предположительно участвующие в регуляции генов, содержат меньшее число доменов со сходной структурой. Такие домены обычно называют «цинковыми пальцами». Белки, их содержащие, функционируют на ранних стадиях развития дрозофилы, более пяти таких белков участвуют в процессе скрещивания дрожжей; к этому же классу относится обычный фактор транскрипции млекопитающих Spl (см. разд. 10.2.8) и большая группа белков-рецепторов стероидного гормона (см. рис. 10-25).

Пока не определена трехмерная структура белков этого типа, и, следовательно, остается неизвестным, как они связываются с ДНК. На рис. 9-10 представлена гипотетическая схема, которую подтверждают данные футпринтинга.

Дата добавления: 2015-08-31