Прижизненное наблюдение

Некоторые палочковидные бактерии являются подвижными. Подвижность обусловлена наличием у них жгутиков, тончайших протоплазматических выростов, которые не видны при микроскопировании в оптическом микроскопе. Наличие жгутиков является видовым признаком и всегда учитывается при определении вида бактерий.

Для изучения подвижности обычно берут односуточные или двухсуточные культуры и готовят из них препарат в раздавленной или висячей капле.

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды, в которую петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры бактерий с твердой питательной среды и размешивают до получения однородной суспензии. Если микроорганизмы выращены в жидкой среде, то берут на стекло капли исследуемой жидкости петлей или стерильной пипеткой. Капля накрывается покровным стеклом.

Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под стеклом, не мешают наблюдению. Если их много, то препарат следует переделать. При опускании стекла на каплю прикасаются ребром стекла к краю капли и, постепенно наклоняя, опускают стекло. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не приливалась за края и не попадала на верхняя сторону покровного стекла. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микробные клетки не заслоняли друг друга. Густые препараты разбавляют водой. Приготовленные препараты рассматривают немедленно, т.к. они быстро высыхают. Для микроскопирования на поверхность покровного стекла наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом 90х, в затемненном поле зрения.

Исследование препарата в раздавленной капле позволяет выявить форму, размеры, подвижность клеток.

Активное движение бактерий следует отличать от механического или пассивного движения. Активно двигающиеся бактерии проплывают через все поле зрения, перегоняют друг друга, меняют направления, совершают вращательные движения. Механическое или пассивное движение наблюдается в высыхающей капле, когда в ней возникают токи жидкости увлекающие клетки, которые движутся с одинаковой скоростью в одном направлении. Клетки бактерий можно наблюдать также в раздавленной капле с прижизненной окраской.

Для этого используются малоконцентрированные растворы красок (в концентрации от 0,01 до 0,0001%), которые не оказывают губительного действия на живую клетку и дифференцированно окрашивают ее содержимое, позволяя более детально изучать некоторые особенности микробной клетки, например, включения отдельных запасных питательных веществ (гликоген, гранулеза и др.).

Для прижизненного окрашивания применяются: нейтральная красная, метиленовая синь, раствор люголя и др. краски.

Прижизненная окраска используется также для того, чтобы выявить мертвые клетки, т.к. последние легко окрашиваются, а живые клетки долгое время не пропускают краску через свою оболочку и остаются неокрашенными.

Окрашивание препаратов и приготовление красителей

В лаборатории практике для окрашивания микробных клеток применяются преимущественно анилиновые краски, которые по своим химическим свойствам подразделяются на основные и кислые.

Из основных красок наиболее часто используются: нейтральная красная, основной фуксин (красные краски), генциан-виолет, метил-виолет (фиолетовые), метиленовая синь (синяя), малахитовая зелень (зеленая) и др.

Из числа кислых красок используется кислый фуксин, эозин (красные) и некоторые другие.

Для изготовления растворов красителей берут сухие анилиновые краски в виде порошков, из которых готовят насыщенные спиртовые растворы. Из этих растворов, путем 5-10 кратного разведения дистиллированной водой, готовят спиртоводные растворы, которые уже используются для окрашивания микробных клеток.

Растворы для окраски фиксированных препаратов:

1. Метиленовая синяя. Насыщенный спиртовой раствор готовят разведением 3 г сухой краски в 100 мл 95° спирта. Через 2-3 дня из полученного раствора приготавливают спирто-водные растворы в концентрации 1:10 или 1:40. Для приготовления таких растворов смешивают 1 мл насыщенного спиртового раствора с 10 мл дистиллированной воды (1:10) или с 40 мл воды (1:40).

2. Фуксин основной. 10 г краски растворяют в 100 мл 95° спирта. 10 мл насыщенного спиртового раствора разводят в 100 мл дистиллированной воды (1:10).

3. Фуксин Циля. К 100 мл 5% раствора карболовой кислоты прибавляют 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина. Карболовая кислота улучшает проницаемость оболочки, облегчает восприятие краски протоплазмой клетки. Поэтому фуксин Циля применяют с целью окраски бактерий и спор бацилл с трудом воспринимающих краску. Карболовая кислота предохраняет краску от порчи и фуксин Циля можно хранить в течение нескольких месяцев.

4. Фуксин Пфейффера. Разводят фуксин Циля в 10 раз дистиллированной водой. Эту краску готовят непосредственно перед окраской препарата, т.к. она быстро разлагается.

5. Генциан-виолет. Сначала готовят насыщенный спиртовой раствор, для получения которого берут 10 г краски на 100 мл 95° спирта, и смесь настаивают трое суток, время от времени встряхивая. К отстоявшемуся раствору добавляют 100 мл 3% раствора карболовой кислоты. Полученную смесь перемешивают, тщательно фильтруют через плотный бумажный фильтр и разливают в капельницы.

При стоянии раствора в капельнице происходит медленная кристаллизация и осаждение части краски. Выпавшие кристаллы, попадая на окрашиваемый препарат, затемняют микроскопическую картину. Поэтому при окрашивании препаратов капельницы не встряхивают и берут только прозрачный раствор краски. Генициан-виолет используется для окраски по Граму.

6. Раствор Люголя. 2г KJ растворяют в 5 мл дистиллированной воды и в этот раствор добавляют 1 г йода. Для ускорения растворения эту смесь растирают в фарфоровой ступке, после чего доливают водой до 300 мл. Используется при окраске бактерий по Граму.

Растворы красителей после изготовления фильтруют, разливают в склянки с притертыми пробками и сохраняют в темном месте. Для повседневной работы краски разливают в капельницы с притертыми пробками. Следует учитывать, что при длительном хранении растворов кристаллы краски могут выпадать в осадок, поэтому препарат рекомендуется окрашивать через полоску фильтровальной бумаги.

В лабораторной практике пользуются простыми и сложными методами окраски микробных клеток.

При простой окраске на фиксированный мазок наносят раствор какого-либо одного красителя, например, разведенного фуксина, который интенсивно окрашивает вегетативные клетки бактерий.

Сущность сложных методов окраски заключается в том, что препарат окрашивают не одной, а двумя или большим количеством красок.

Дата добавления: 2015-06-27